基本方案

用AUTOMACS系統(tǒng)進(jìn)行總T細(xì)胞、CD4⁺細(xì)胞或CD8⁺T細(xì)胞的自動(dòng)分離

 

實(shí)驗(yàn)材料

1、小鼠

2、HBSS洗滌緩沖液

3、MACS緩沖液

4、磁珠

5、RPMI-10完全培養(yǎng)基

6、AUTOMACS系統(tǒng)和分選柱

7、30μm尼龍網(wǎng)或40μm預(yù)分離濾膜

 

1、用5只小鼠的淋巴結(jié)或2只小鼠的脾臟制備單細(xì)胞懸液并去除紅細(xì)胞。

 

2、細(xì)胞在10mlHBSS洗滌緩沖液中混懸后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

 

3、細(xì)胞懸液在4℃，200g離心10min。棄上清后將沉淀按每10⁸個(gè)細(xì)胞0.9ml MACS緩沖液的比例混懸。每10⁸個(gè)細(xì)胞加入0.1ml適當(dāng)?shù)拇胖楹笤?℃孵育15min。

 

4、在孵育的時(shí)間里，打開(kāi)AUTOMACS系統(tǒng)電源。按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中操作規(guī)程運(yùn)行清潔程序。

 

5、細(xì)胞懸液在4℃，200g離心10min。棄上清，在沉淀中加入足量的MACS緩沖液使細(xì)胞濃度達(dá)到10⁸個(gè)細(xì)胞/ml，充分混懸。將細(xì)胞通過(guò)30μm尼龍網(wǎng)或40μm預(yù)分離濾膜。用0.1～0.4mlMACS緩沖液沖洗濾網(wǎng)。

 

6、細(xì)胞放到AUTOMACS的上樣通道。選擇possel程序，這樣標(biāo)記的細(xì)胞將從陽(yáng)性通道洗脫。

 

7、細(xì)胞懸液在4℃，200g離心10min。棄上清后將沉淀用2～5ml RPMI-10完全培養(yǎng)基混懸。計(jì)數(shù)。

 

附錄：

RPMI完全培養(yǎng)基：

       RPMI1640培養(yǎng)基含有:

       2%、5%、10%、15%或20%FBS,56℃熱滅活1h

       2μmmol/L L-谷氨酰胺

       50μmol/ml 2-ME

       100U/ml 青霉素

       100μg/ml 硫酸鏈霉素

 

RPMI-10完全培養(yǎng)基：

       配制RPMI完全培養(yǎng)基加入:

       10%（V/V）FBS

       1mmol/L 丙酮酸鈉

       50μg/ml慶大霉素

       10mmol/L HEPES

       4℃可保存2周

       過(guò)濾除菌

 

HBSS洗滌緩沖液：

       HBSS，含有：

       5%（V/V）FBS

       20mmol/L HEPES，pH7.0

       100U/ml 青霉素

       100μg/ml 鏈霉素

       4℃可保存1個(gè)月

 

MACS緩沖液：

       PBS，pH7.2

       0.5%（m/V）BSA

       2mmol/L EDTA

       過(guò)濾除菌

       用于自動(dòng)MACS系統(tǒng)，室溫儲(chǔ)存1個(gè)月

       用于LS或LD柱時(shí)，脫氣，4℃保存