1.針對目的基因序列選擇合適的擴(kuò)增片斷

查看以下三個網(wǎng)站是否有合適的已經(jīng)證實的QRT-PCR的擴(kuò)增引物,探針以及反應(yīng)條件.

RTPrimerDB (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb), 相對物種較多

PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html) 人，鼠

Real Time PCR Primer Sets (http://www.realtimeprimers.org) 人，mouse，rat

如果沒有合適的或者已經(jīng)證實的可以提供參考,以下的設(shè)計方案僅供參考:

A.最廣泛使用的商業(yè)化的軟件Beacon Designer(http://www.premierbiosoft.com)

B.DIY的軟件Primer Express

C.如果Beacon Designer 無法得到您說需要的結(jié)果,或者獲得到設(shè)計方案的備選數(shù)目不夠的話,可以選擇Sigma-Genosys http://)的服務(wù)方案,詳細(xì)周到

D.一個免費的基于網(wǎng)頁構(gòu)架的引物和探針設(shè)計程序: http://www.biosearchtech.com/products/probe_design.asp

您可以挑選其中的4-6對引物進(jìn)行試驗,選擇引物的擴(kuò)增效率和靈敏度高的.這個軟件可以直接與NCBI的網(wǎng)站進(jìn)行比對,并且用NCBI的ePCR進(jìn)行虛擬的電子PCR

引物設(shè)計簡介

DNA引物長度:15-25 個堿基

GC含量:50%左右

如果引物的與AT區(qū)域富集結(jié)合,可以考慮用LNA替換幾個堿基,較少引物的長度以及避免引物次級結(jié)構(gòu)和3’端二聚體的影響.由于引物和模板和探針與靶點之間的分之間的相互競爭,分之內(nèi)雜交,倒轉(zhuǎn)重復(fù)等等會引起引物的引發(fā)探針對結(jié)合效率達(dá)降低,因此我們選擇引物二聚體的△G為負(fù)值,即:<10 kcal/mol.沒有連續(xù)的G/C.

引物探針的保存一般遵循以下原則:

正向和反向引物保存在-20度, 濃度為10mM 或者10×工作濃度.探針應(yīng)該避光保存，貯存在-70度,最好以凍干粉狀態(tài)，工作濃度的液體保存一般兩周左右。

2.輸入靶序列，用BLASTn在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast進(jìn)行比對

3.檢查比對序列的多態(tài)性以及可能的錯誤避免這些區(qū)域來進(jìn)行引物和探針設(shè)計

4.在靶序列中避免直接待重復(fù)區(qū)，在重復(fù)區(qū)進(jìn)行雜交容易使得引物非獲得產(chǎn)物性結(jié)合，降低DNA的擴(kuò)增效率以及減少分析的靈敏度。

5.考慮到潛在的剪接變異體以及合適的所需要的獲得到靶，通過學(xué)分析內(nèi)含子以及外顯子的邊界，主要通過cDNA和基因組序列比對來確定。一般都設(shè)計跨最長內(nèi)含子區(qū)，這樣減少了擴(kuò)增子受到基因組DNA的污染的影響。這是十分有必要的，特別當(dāng)用DNA做歸一化處理以及靶向某一特異的剪接變異體。最經(jīng)濟(jì)的做法是讓下游引物跨越剪接接頭，這樣允許使用一條探針檢測可能剪接變異體.然后如果在有效性和靈敏度無法保證情況下，可以使用跨越單一外顯子的設(shè)計方案。我們還是建議試驗者用DnaseI處理樣品，除去gDNA的污染。

6.在RT步驟時，用(http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi)工具檢測在特定溫度下靶序列的折疊情況，避免一些高度次級結(jié)構(gòu)的區(qū)域，那些區(qū)域探針和引物結(jié)合效率較低

7.盡可能用60-150bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，GC含量在60％或者稍小來確定高效的變性，更高度反應(yīng)效率。GC含量高度序列容易產(chǎn)生非特異性的反應(yīng)，短序列擴(kuò)增是的擴(kuò)增時間縮短gDNA污染可能性減少。短的序列容易人工合成，用來做擴(kuò)增多標(biāo)準(zhǔn)曲線。用oligodT進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄最好設(shè)計擴(kuò)增子位于靠近模板的3’區(qū)域。