生物發(fā)光特征與應用

生物發(fā)光（bioluminescence、BL）是指生物體發(fā)出的光輻射，是生物體釋放能量的一種形式，這種發(fā)光現(xiàn)象廣泛地分散在生物界中。它不依賴于有機體對光的吸收，而是一種特殊類型的化學發(fā)光，也是氧化發(fā)光的一種。生物發(fā)光的一般機制是：由細胞合成的化學物質(zhì)，在一種特殊酶的作用下，使化學能轉(zhuǎn)化為光能。自然界具有發(fā)光能力的有機體種類繁多。一些細菌和高等真菌有發(fā)光現(xiàn)象。動物界25個門中，就有13個門28個綱的動物具有發(fā)光現(xiàn)象，從最簡單的原生動物到低等脊椎動物中都有發(fā)光動物，如鞭毛蟲、海綿、水螅、海生蠕蟲、海蜘蛛和魚等。動物的發(fā)光，除其自身發(fā)光即一次的發(fā)光以外，由寄生或共生而產(chǎn)生二次發(fā)光的例子也不少。不同生物體的發(fā)光顏色不盡一致，多數(shù)發(fā)射藍光或綠光，少數(shù)發(fā)射黃光或紅光。

目前，根據(jù)發(fā)光的機理不同國際上將生物發(fā)光分為四種
1．受激熒光是指生物體在受到外界光輻射的作用時，體內(nèi)固有的熒光物質(zhì)或吸收的熒光標記物發(fā)光的現(xiàn)象。 2．發(fā)光生物發(fā)光。以螢火蟲的閃光為代表。 
3．化學發(fā)光 
化學發(fā)光是在化學反應過程中(主要為氧化還原反應)發(fā)出可見光的現(xiàn)象�；瘜W發(fā)光反應是由兩個關(guān)鍵步驟組成：激發(fā)和發(fā)射。許多化學反應進行時能釋放足夠的自由能而把參加反應的物質(zhì)之一激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，生成一種激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，在它回到基態(tài)時，剩余能量轉(zhuǎn)變成光子能量產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。 
4．生物超微弱發(fā)光 
隨著生物發(fā)光研究的進一步深入，發(fā)現(xiàn)人體的器官、組織、細胞、乃至大分子都在發(fā)光，不過發(fā)光強度更弱。目前研究已涉及到細胞、亞細胞乃至生物大分子的層次。越來越多的實驗表明，DNA 是生物超微弱發(fā)光的一個輻射源。

生物發(fā)光還可分為:
1．被動發(fā)光：如植物，那些微弱的紅光是沒能參與光合作用多余的光，一般的看法是這種光無意義。
2. 主動發(fā)光：如螢火蟲的閃光。
另外，有些動物本身并不會發(fā)光，但在共生的環(huán)境中它們會利用發(fā)光細菌的光為自己服務。
動物的發(fā)光器有兩類，一類具有發(fā)光細胞，另一類具有共生的發(fā)光細菌
發(fā)光細胞是起源于皮膚而發(fā)生了變異和特化的腺細胞，能分泌熒光素和熒光素酶。           如果發(fā)光細胞內(nèi)同時含有熒光素和熒光素酶，則發(fā)光可在細胞內(nèi)進行，此稱細胞內(nèi)發(fā)光；如果發(fā)光細胞內(nèi)僅含有熒光素或熒光素酶，則發(fā)光必須在分別含有熒光素和熒光素酶的不同發(fā)光細胞之分泌物相遇時才能產(chǎn)生，此稱細胞外發(fā)光。

生物發(fā)光的機制：
熒光素酶（Lu ciferase）以熒光素（Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O2為底物，在Mg2＋存在時，底物在催化循環(huán)中會形成還原型核黃素磷酸鹽和醛化合物，當遇到熒光素酶和氧時，形成一種激發(fā)的絡合物。絡合物斷裂時生成氧化核黃素磷酸鹽、酸、水及一個光子，化學能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽堋?
熒光素+ ATP+ O2→核黃素磷酸鹽+醛化合物

核黃素磷酸鹽+醛化合物→激發(fā)的絡合物

激發(fā)的絡合物→氧化核黃素磷酸鹽+酸+水+光子

化學能→光能

ATP既是熒光素酶催化發(fā)光的必需底物，又是所有生物生命活動的能量來源。在熒光素酶催化的發(fā)光反應中，ATP在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā)光強度呈線性關(guān)系。

生物發(fā)光的特點： 
1 生物發(fā)光的顏色范圍很寬，可從紅光到深藍光；
2 氧是幾乎所有生物發(fā)光系統(tǒng)中必須的因素；
3 生物發(fā)光是由“熒光素酶”與“熒光素”的化學反應所引起的；
4 所有的生物發(fā)光反應幾乎都是酶-底物類型的反應，但復雜程度不同，某些生物發(fā)光反應涉及3種或4種底物，而另一些生物發(fā)光反應甚至需要3個或4個酶的體系。
5 高效率。在發(fā)光的同時，沒有輻射熱能的消耗，因而生物發(fā)光的效率是很高的。幾乎能將化學能百分之百地轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢姽�，為普通電光源效率的幾倍到幾十倍�?
6 安全性。因為冷光本身無熱，所以沒有爆發(fā)火花的危險，在油庫、炸藥庫、礦井等易燃易爆場所，用其作照明光源最為理想，因此被稱為“安全之光”。

生物發(fā)光的應用
1. ATP生物熒光檢測
ATP生物熒光檢測是基于熒火蟲發(fā)光機理所設計，熒火蟲發(fā)光細胞內(nèi)具有特殊的發(fā)光物質(zhì)-熒光素及熒光素酶，熒光素易被氧化，它在熒光素酶催化下，由ATP激活，使之與氧結(jié)合，熒光素分子中的電子躍遷到高能級，處于不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，當電子跳回到低能級時，即發(fā)出熒光光子。由于ATP能不斷提供能量，因而熒光素分子不斷地被激活，即可連續(xù)地發(fā)出熒光，其熒光強度與ATP濃度在一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系，通過用發(fā)光光度計，可以檢測出待測液中ATP含量。該法靈敏度極高，可檢測出10μl樣品中的ATP含量。研究表明，各生長期的細菌均有較恒定水平的ATP含量，因此，提取細菌的ATP，利用生物發(fā)光法測出ATP含量后，即可推算出樣品中的含菌量，整個過程僅為十幾分鐘。由于生物發(fā)光法無需培養(yǎng)微生物過程，操作簡便、靈敏度高，在短時間內(nèi)即可得到檢測結(jié)果，具有其他微生物檢測方法無可比擬的優(yōu)勢，是目前檢測微生物最快的方法之一 .

2. 利用生物發(fā)光蛋白測定細胞內(nèi)游離Ca2+ 

Ca2+對細胞的代謝與功能的調(diào)節(jié)作用幾乎涉及到細胞的所有生理和生化過程。細胞內(nèi)游離Ca2+濃度及其分布的變化代表著某種細胞功能的啟動、加強和抑制，是形成Ca2+信號的基礎(chǔ)。研究Ca2+與細胞功能的關(guān)系具有十分重要的意義。利用光蛋白與Ca2+反應極其靈敏的特性，可以測出微量Ca2+的含量。
1967年，Ridgway和Ashley用從水母(acguoreaforskalea)中分離出的一種蛋白質(zhì)—水母發(fā)光蛋白(acguorin)，第一次成功地測定了活細胞內(nèi)[Ca2+]。水母蛋白與Ca2+結(jié)合后激活而發(fā)出藍色熒光(465mm)，在0.1～10μmol/L Ca2+范圍內(nèi)熒光強度與[Ca2+]成正相關(guān)，是目前應用最廣的一種Ca2+生物發(fā)光指示劑。 Ca2+生物發(fā)光指示劑不受光漂白效應的影響，對細胞無毒性.  

3應用在免疫檢測中進行標記物的超靈敏檢測。
BL反應已經(jīng)被證明是檢測酶標記的極為靈敏的方法，依賴于螢火蟲熒光素酶熱穩(wěn)定突變體標記的醋酸激酶BL檢測可以得到極低的檢測極限(8.5x10-23 mol)

4．微孔板上的生物發(fā)光
基于超靈敏的光電耦荷裝置（CCD）的成像系統(tǒng)，可以同時測量整個384孔板的BL信號。其中每個孔的信號都會通過對BL數(shù)字圖象進行軟件分析得到精確的定量。通過對直觀可視信號的評估，測量得到的BL光信號會被轉(zhuǎn)變成假色，而更加突出不同的光強度，如

5. 酶抑制劑篩選
一種BL檢測方法可以用來檢測蛋白酶活性。水母融合蛋白(配合一個最優(yōu)的自然蛋白酶酶切位點)被固化在微孔板空內(nèi)，作為HIV-1蛋白酶的底物。蛋白酶水解鍵后從固態(tài)上釋放出水母蛋白，從而增加了BL信號。這個系統(tǒng)可以通過在BL融合蛋白中引入特定的酶切位點而針對不同蛋白酶進行抑制劑篩選。

6．活體動物成像
BL反應所產(chǎn)生的可見光可以部分的透過動物組織，因此可以在整體動物的模式下進行成像。BL全體細胞和分子成像作為一種靈敏、可定量、非侵入性的和實時的方法，可以用來對活體動物進行生物學研究，并將對生物技術(shù)、分子醫(yī)學、基因治療和藥物研發(fā)等領(lǐng)域產(chǎn)生深遠的影響。

7．體內(nèi)基因表達 
體內(nèi)基因表達模式方面的研究。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，科學家通過可發(fā)光轉(zhuǎn)基因動物（例如：大鼠或小鼠基因組中整合了修飾的內(nèi)源基因和BL報告基因）作為人類疾病的模式動物進行目標確認的研究。 例如：目前已經(jīng)建立了一個轉(zhuǎn)基因小鼠模型，可以監(jiān)測編碼人細胞色素P450 3A4（CYP3A4）基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，人細胞色素P450 3A4在藥物代謝方面起著重要作用。

8．傳染性疾病 
疾病的進程和治療劑的功效可以通過對小鼠注射BL標記進行評估。例如注射經(jīng)過修飾的病原微生物，然后對透過動物組織的光進行成像。使用這種方法，可以檢測活小鼠胃腸道內(nèi)重組的發(fā)光沙門氏菌的定殖和不同的喂食物質(zhì)對其的影響。

9. 腫瘤研究 
與藥物功效研究相同，腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，可以通過活體中注射BL重組腫瘤細胞，再成像進行監(jiān)測。 另一種方式，初期的腫瘤和不確定的轉(zhuǎn)移可以通過使用基因工程的發(fā)光細胞作為探針進行定位。 
a human colon carcinoma xenograft 模式中已經(jīng)開始使用雙標記，一個標記檢測特定基因的轉(zhuǎn)錄活性，另一個組成性表達，作為一個內(nèi)參照物。

10. 細胞移植 
心臟細胞移植中胚胎心臟成肌細胞的位置、數(shù)量和存活時間可以在活體動物中進行非侵入行的監(jiān)測。 體內(nèi)BL成像同樣提供了一種新的可以動態(tài)檢測移植的人造血干細胞的方法。其他的生物學過程同樣可以通過BL標記后活體成像進行研究，比如細胞凋亡、蛋白-蛋白互作和效應細胞功能等等。使用這種方法可以在活體中進行客觀的、可定量的檢測，成為藥物篩選的一個重要工具。

11．生物發(fā)光傳感器 
BL被作為一個檢測系統(tǒng)在生物傳感器中使用，嚴格意義上是指作為生物識別系統(tǒng)中的分析裝置并與傳導裝置接觸，相關(guān)的酶被固定在各種不同形式的裝置上。這些系統(tǒng)主要是基于耦連的酶促反應并引發(fā)光子的發(fā)射。