高通量測序發(fā)展的背景

基因決定了一個人的相貌、身高甚至疾病，它存在于每個人體細胞的ＤＮＡ中。而組成ＤＮＡ的基本物質(zhì)則是由Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ表示的４種堿基，一個人的基因組測序就是排列出其ＤＮＡ上所有堿基的順序。如果每個人都能擁有一份屬于自己的基因組圖譜，那么科學(xué)家們長期以來期待的“個性化醫(yī)療時代”就會可能成為現(xiàn)實，藥品會根據(jù)個人不同的 DNA 量身定制。

但目前的測序費用還是極其昂貴的，非普通人所能企及�？茖W(xué)家正在研究新一代測序儀器和方法，希望有朝一日能把破譯個人“基因密碼”的費用降低到 1000 美元。如果能夠?qū)崿F(xiàn)，普通民眾就有望在必要情況下可以把基因組測序變成一項常規(guī)檢查項目。

測序成本不斷下降

幾年前，由六個國家 16 個中心以及全球眾多科學(xué)家共同完成的 “ 人類基因組計劃 ” （ HGP ），首度解讀了人體 DNA 中所隱藏的、完整描述造就和維持人體生命的說明書。該計劃從 90 年啟動通過 10 余年的工作，共花費了近 30 億美元。而這其中 1995 年文特爾曾發(fā)明了著名的 “ 基因組鳥槍測序法 ” 。這種方法將基因組 DNA 切斷成小片斷，分別測序，再將他們拼接起來，大大加快了基因組測序的速度。即便如此，科學(xué)家也用了 10 余年的時間才完成了人類基因組的第一次測序工作。由于越來越多的領(lǐng)域需要用到基因組測序，開發(fā)更快更便宜的測序方法成為急迫的課題。

以末端終止法為核心第一代測序技術(shù)－化學(xué)測序方法，成型于上世紀 80 年代。測序時， DNA 分子被切斷為大的片段，測得大片段的序列后，繼續(xù)將大片段剪切為小片段，逐步測定整個基因組順序，這種方法費事費時，需要大量的技術(shù)人員參與，耗費大量財力。

開始于上個世紀 90 年代的第二代測序技術(shù)，是以集成化、自動化為基礎(chǔ)的基因測序技術(shù)，為大規(guī)模的基因測序奠定了基礎(chǔ)，測序方法也從平板膠電泳發(fā)展為毛細管電泳。從而將包括人類基因組計劃在內(nèi)的多個生物的全基因組的測序完成，其通量較第一代有明顯的大幅度的提升（代表機型： 310 、 377 、 3700 、 3100 、 3730 MegaBACE1000 、 4000 、 4500 ）。但是 ，昂貴的科研費用還是意味著，大規(guī)模基因測序工作大多只能局限于專業(yè)測序中心來完成，供大型、昂貴的研究項目之用。

近年，出現(xiàn)了一些新的技術(shù)和方法。這些技術(shù)和方法不斷得到創(chuàng)新 和改良，在保證基因組測序足夠精確度的前提下， 操作程序的優(yōu)化，測定一種基因組變得越來越簡單起來， 測試的成本也呈現(xiàn)直線下降的趨勢 �，F(xiàn)在一種被稱為 “ 革命性的基因組測序技術(shù) ” 的全新測序方法，使科學(xué)家們希望只要花費一千美元即可測得一個人的全基因組即將成為可能。

Solexa 高通量測序法原理

Solexa 方法是利用單分子陣列測試 genotyping ，此種測序法首先是將 DNA 從細胞中提取，然后將其打斷到約 100 － 200bp 大小，再將接頭連接到片段上，經(jīng) PCR 擴增后制成 Library 。隨后在含有接頭的芯片（ flow cell ）上將已加入接頭的 DNA 片段綁定在 flow cell 上，經(jīng)反應(yīng)，將不同片段擴增。在下一步反應(yīng)中，四種熒光標記的染料應(yīng)用邊合成邊測序（ Sequencing By Synthesis ）的原理，在每個循環(huán)過程里，熒光標記的核苷和聚合酶被加入到單分子陣列中�；パa的核苷和核苷酸片斷的第一個堿基配對，通過酶加入到引物上。多余的核苷被移走。這樣每個單鏈 DNA 分子通過互補堿基的配對被延伸，利用生物發(fā)光蛋白，比如螢火蟲的熒光素酶，可通過堿基加到引物后端時所釋放出的焦磷酸鹽來提供檢測信號。針對每種堿基的特定波長的激光激發(fā)結(jié)合上的核苷的標記，這個標記會釋放出熒光。熒光信號被 CCD 采集， CCD 快速掃描整個陣列檢測特定的結(jié)合到每個片斷上的堿基。通過上述的結(jié)合，檢測可以重復(fù)幾十個循環(huán)，這樣就有可能決定核苷酸片斷中的幾十個堿基。

Solexa 的這種方法，可在一個反應(yīng)中同時加入 4 種核苷的標簽，采用邊合成邊測序（ SBS － sequencing by synthesis ），可減少因二級結(jié)構(gòu)造成的一段區(qū)域的缺失。并具有所需樣品量少，高通量，高精確性，擁有簡單易操作的自動化平臺和功能強大等特點，此反應(yīng)可以同時檢測上億個核苷酸片斷 , 因此在同一個芯片或幾個芯片上花費很少（只需常規(guī)方法的 1 ％）的成本就可測試全基因組。

 隨著 DNA 測序表達譜產(chǎn)品（ DNA sequencing ,expression profiling ）以及 microRNA 分析平臺 -Solexa Genome Analysis System. 相繼問世，使得此種方法在更多的領(lǐng)域得到應(yīng)用。

Illumina公司的Solexa測序技術(shù)為廣大用戶提供了強大的下一代測序方法，為目前遺傳分析和功能基因組等熱門研究領(lǐng)域的部分熱門課題提出了全新的應(yīng)用方案。

測序與重測序

無論您需要測定的是整個基因組的序列還是基因組上一個大片斷候選區(qū)域的序列， Illumina Genome Analyzer系統(tǒng)都是當(dāng)今世界上最先進、最經(jīng)濟的平臺。Solexa測序技術(shù)和可逆中止化合物染料（reversible terminator chemistry）奠定了在下一代測序技術(shù)中高質(zhì)量、高通量、低成本數(shù)據(jù)產(chǎn)出的基礎(chǔ)。

表達譜分析

通過對樣本中數(shù)以百萬計的cDNA標簽同時進行序列測定，Genome Analyzer系統(tǒng)可以使您對整個轉(zhuǎn)錄組進行數(shù)字化的分析，而成本僅僅維持在與目前其他模擬化分析技術(shù)同樣的水平。由于我們的技術(shù)無需利用任何轉(zhuǎn)錄子特異性雜交探針，您可以同時進行全基因組轉(zhuǎn)錄子的發(fā)掘與定量分析，而無需事先知道基因組的注釋情況。

小RNA鑒定與定量分析

Solexa測序技術(shù)可以提供一套全新獨特的，適用于各個物種的小RNA深度鑒定與定量分析研究平臺。通過大量的平行測序，研究人員可以發(fā)掘、鑒定并定量出任何物種全基因組水平的小RNA圖譜。應(yīng)用這種低成本快速測定數(shù)百萬標簽序列的新方法，Illumina Genome Analyzer提供了解密小RNA圖譜獨一無二的方法。