農(nóng)業(yè)領域中的應用-高分辨熔解曲線分析技術
高分辨熔解曲線分析技術（High Resolution Melting Curves Analysis）是近年來發(fā)展起來的一種檢測基因突變和刷選SNP的新方法。這種方法也可以與標記和非標記探針結合對已知位點的突變和SNP進行檢測以及用于SSR（STR）等短串聯(lián)重復分子標記分析。
該技術已經(jīng)被大規(guī)模應用于醫(yī)學領域中，用來分析和篩選導致人類疾病的基因的突變研究。一系列的研究證明，高分辨熔解曲線分析技術是篩選SNP和進行基因分型工作的迅速、廉價而有效的方法。
目前，高分辨熔解曲線分析技術開始越來越多的被應用在農(nóng)業(yè)領域的研究中，并且取得不少成績。其中比較有代表性的研究單位有英國洛桑農(nóng)業(yè)試驗站、中國科學院發(fā)育與遺傳研究所、中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所、中國林業(yè)研究院熱帶林業(yè)研究所等。
下面，簡單介紹一下高分辨熔解曲線在農(nóng)業(yè)領域中的應用。
小麥是世界上普遍種植的糧食作物，對人類的可持續(xù)發(fā)展有重要的影響。英國環(huán)境、食品和農(nóng)業(yè)事務部小麥遺傳改良工作組(Defra Wheat Genetic Improvement Network)與英國洛桑農(nóng)業(yè)試驗站合作建立了采用高分辨熔解曲線進行基因突變分析的研究平臺。研究者采用化學誘變劑甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)對春小麥進行誘變，然后采用高分辨熔解曲線分析的方法(LightScanner™ 系統(tǒng)和LCGreen Plus染料)對處理后的樣品進行掃描，證明這種方法在研究小片段的基因靶序列時有很高的靈敏度與成功率，并且在研究那些外顯子較小而內(nèi)含子很大的基因時特別有效。
下圖為采用LightScanner系統(tǒng)和LCGreen染料對EMS誘變后的春小麥進行的高分辨熔解曲線分析。
圖1. GA20ox1D中的高分辨熔解曲線進行的突變掃描。野生型的小擴增片段為灰色，可能的突變體用紅色顯示。
大麥輕性花葉病毒（BaMMV）和大麥黃色花葉病毒（BaYMV）可以導致大麥的黃花葉病，嚴重影響大麥的產(chǎn)量。隱形等位基因rym4和rym5對BaMMV和BaYMV有抗性，在歐洲被用在大麥的育種工作中。英國洛桑農(nóng)業(yè)試驗站最近發(fā)現(xiàn)rym4和rym5以及rym6與真核轉錄起始因子4E（eIF4E）的突變等位基因相當。對植物的eIF4E基因及其亞型eIF(iso)4E的研究有助于了解抗病機制。洛桑農(nóng)業(yè)試驗站的研究者們在世界范圍內(nèi)收集大麥主要種植地的大麥樣品，采用基于cDNA的高分辨熔解曲線分析的方法(cDNA-based high-resolution melting）對其中1100個樣品的eIF4E基因進行突變篩查。英國洛桑農(nóng)業(yè)試驗站采用這種高通量低成本的研究方法掃描了eIF4E基因編碼序列的突變位點，對含有突變的基因進行了測序，成功的鑒定出了大于30個不同的eIF4E等位基因的突變，大大節(jié)省了測序工作的成本和精力。
下圖為英國洛桑農(nóng)業(yè)實驗站采用LightScanner儀器對不同樣品中eIF4E基因的高分辨熔解曲線的分析結果。其中，藍色和紅色的曲線所代表的樣品均為突變型，灰色的為野生型樣品。
圖2. 采用高分辨熔解曲線(LightScanner™ system; Idaho Technology Inc.)對eIF4E的突變等位基因進行篩選。
多倍體植物因其基因的多拷貝，一個等位基因上隱性突變所造成的影響常被其他同源拷貝所彌補；另外，多拷貝基因也常常給測序工作帶來麻煩，這些原因使得研究多倍體作物更為困難。采用混合樣品的高分辨熔解曲線分析的方法常常對突變檢測和基因型研究有意想不到的效果。基本原理是同一個SNP位置上兩個不同的純和突變子通過混合會產(chǎn)生一個類似雜合子的熔解曲線。如果是兩個相同的基因型的樣品，則混合后產(chǎn)生的熔解曲線不會發(fā)生變化。中科院遺傳所的中科院某實驗室采用該方法對小麥親本的基因型進行分析。中科院某實驗室將兩個親本中的任意一株的熔解曲線與子一代的熔解曲線進行比較，如果兩條熔解曲線相同則證明兩株親本樣品的基因型一樣。如果不同，則證明兩株親本樣品基因型不同。這種方法快速而有效的幫助中科院某實驗室解決了如何確定親本的基因型是否相同的問題。
下圖為中科院某實驗室采用LightScanner系統(tǒng)對已知的親本樣品和子一代的熔解曲線進行的驗證實驗。
圖3-A不同基因型的親本和子一代的熔解曲線。紅色的曲線和灰色的曲線代表的樣品被LightScanner認為是野生型和突變。
圖3-B 相同基因型的親本和子一代的熔解曲線。親本和子一代被LightScanner認為均屬野生型樣本。
圖3-A中的兩個親本樣品的基因型是不同的。將子一代與親本樣品的PCR產(chǎn)物在LightScanner系統(tǒng)上進行高分辨熔解曲線分析，被LightScanner系統(tǒng)認為是野生型和突變型，表明兩個親本的基因型不同。圖3-B中的兩個親本樣品的基因型相同，將子一代與親本樣品的PCR產(chǎn)物在LightScanner系統(tǒng)上進行高分辨熔解曲線分析，被LightScanner系統(tǒng)認為均是野生型，表明兩個親本的基因型相同。該方法在研究多倍體細胞時，可以快速簡便的鑒定樣品的基因型是否相同。
隨著測序技術與生物信息技術的發(fā)展，各種模式生物的基因組信息越來越完善，其他物種的基因組也在不斷的被測序。但是，可以想象，地球上的生物種類如此豐富，不可能對每個物種的基因組都進行測序。因此，在研究那些基因組信息不全的物種時就會給研究帶來不少麻煩。澳大利亞新英格蘭大學采用高分辨熔解曲線與EST數(shù)據(jù)庫相結合的方法來研究整個杏樹基因組中的SNPs。他們從NCBI Genebank中的EST數(shù)據(jù)庫中得到3864 條杏樹的EST序列，同時結合杏樹和桃樹的SNP數(shù)據(jù)庫來篩選潛在的SNP。然后通過高分辨熔解曲線分析的方法對25個杏樹變種中推測的SNP進行篩選與驗證。結果發(fā)現(xiàn)杏樹中SNP的發(fā)生頻率為1：114bp，轉換與顛換的比例為1.16：1；同時證明高分辨熔解曲線分析方法是篩選SNP和進行基因分型工作的快速有效且成本低廉的研究方法，并且特別適合于研究基因組信息很少的生物。
下圖為澳大利亞的研究者對兩個不同的小的擴增片段進行的高分辨熔解曲線的分析。
圖4. 高分辨熔解曲線對兩個含有SNP位點的Xneas280a和Xneas109a小擴增片段進行的分析。其中，a為Xneas280a的熔解曲線圖，b是對圖a做的差異圖，c為Xneas109a的熔解曲線圖，d是對圖c做的差異圖。
高分辨熔解曲線分析技術自從開發(fā)出來后，因其迅速，廉價和高通量等特點而被迅速的應用到了醫(yī)學診斷領域的研究中。越來越多的研究證明，該技術同樣適用于農(nóng)業(yè)領域關于SNP篩選，基因分型和品種鑒定等方向的研究。隨著對作物研究的不斷深入，該技術也必會被更廣泛的應用在農(nóng)業(yè)領域的研究中。
