高分辨率熔解曲線分析甲基化研究應(yīng)用
—表觀遺傳學(xué)中檢測CpG位點(diǎn)的一種新技術(shù)
甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(MS-Hi-Res Melting®)是一種不需要PCR產(chǎn)物后續(xù)操作的,簡單且靈敏的檢測基因甲基化水平的方法。該方法主要通過比較曲線的熔解溫度和峰形得以實(shí)現(xiàn)。該方法可以在一系列的CpG位點(diǎn)中檢測出單一的一個(gè)甲基化的發(fā)生,同時(shí),也可以對(duì)一系列的CpG位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行分析。
單個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化和平均的甲基化水平會(huì)對(duì)熔解曲線的形狀造成影響。采用重亞硫酸鹽處理DNA模板可以使5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。在PCR反應(yīng)中,尿嘧啶可以與腺嘌呤配對(duì),最終使得胞嘧啶轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶。樣品中的GC含量發(fā)生了變化,最終被轉(zhuǎn)化成了熔解曲線Tm值之間的差異。CpG位點(diǎn)在小的擴(kuò)增片段內(nèi)的相對(duì)位置也會(huì)對(duì)熔解峰的形狀產(chǎn)生影響,因此,Tm值和熔解峰的形狀可以被用在表觀遺傳學(xué)的研究中。
對(duì)于甲基化研究中一些常見的問題,我們采用了有三種方法來克服。1,采用商品化的試劑來減少復(fù)制過程中的堿基轉(zhuǎn)變之間的差異;2,重亞硫酸鹽處理過的DNA會(huì)迅速的降解,我們的結(jié)果證明樣品在4°C下可在TE緩沖液中保存幾個(gè)月;3,采用內(nèi)部的熔解溫度校正,盡量減少樣品之間的差異。
示例:我們擴(kuò)增了一個(gè)含有5個(gè)CpG位點(diǎn)的miRNA-195基因片段。發(fā)現(xiàn)采用高分辨率的儀器LightScanner和飽和染料LCGreen Plus適用于檢測的甲基化水平從10%到100%,并且當(dāng)一段基因的甲基化水平在39%和40%之間時(shí),儀器也能區(qū)分出細(xì)微的熔解曲線之間的差異。通過實(shí)驗(yàn)有如下發(fā)現(xiàn):1,小的復(fù)制片段的Tm值隨著甲基化水平的增加而增加;2,采用內(nèi)部的校正可以改善Tm值和平均甲基化之間的相關(guān)性;3,異源二聚體含量的增加能夠擴(kuò)大衍生熔解峰形狀之間的差異,并且采用商品化的試劑盒可以延長經(jīng)重亞硫酸鹽處理過的DNA樣品的保存時(shí)間;4,熒光定量PCR的檢測證明模板有較好的穩(wěn)定性。
圖1:用于研究的材料中的甲基化平均水平的分布情況。miRNA-195基因的小擴(kuò)增片段中含有的5個(gè)CpG位點(diǎn)被用來做研究。平均的甲基化水平通過測序得到的相對(duì)C:T峰的高度來估算。圖中的顏色代表不同的樣品,在下面的圖中也采用同樣的標(biāo)準(zhǔn)。
圖2:甲基化水平的不同導(dǎo)致的Tm值之間的差異。通過校正可以加強(qiáng)甲基化水平和Tm值之間的相關(guān)性。在上面的兩幅圖中,圖A是沒有校正的衍生熔解峰,圖B是觀測到的Tm值和平均的甲基化水平之間的相關(guān)性。在下面的兩幅圖中,圖C是校正過的衍生熔解峰,圖D是觀測到的Tm值和平均的甲基化水平之間的相關(guān)性。通過校正,數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性得到了改善。平均的甲基化水平如下:粉色(100%),深綠色(40%),淺綠色(40%),橘黃色(39%),深藍(lán)色(10%),淺藍(lán)色(8%)。注意:橘黃色的樣品的相對(duì)位置在校正過以后和綠色樣品的Tm值更為接近(圖C所示),這和測序得到的結(jié)果是吻合的。
圖3:未進(jìn)行校正的一些腫瘤樣品和過作為對(duì)照的過甲基化樣品的衍生熔解峰。152bp miRNA-195小擴(kuò)增片段5個(gè)CpG位點(diǎn)的平均甲基化水平如下:粉色(100%),深綠色(40%),淺綠色(40%),深藍(lán)色(10%)。如在上圖A中所示,代表過甲基化樣品的粉色峰和低甲基化樣品的深藍(lán)色峰形狀上都更尖銳,可以由樣品中存在很少的異源雙鏈的含量來解釋。深綠色和淺綠色峰形的差異可能是由于在2,4,5的甲基化位點(diǎn)上的甲基化位點(diǎn)特異性所引起的。
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