新一代非基于“桑格技術(shù)”的基因測序法以空前的快速測序速度問世了，它為人類帶來了重大的科學(xué)成果和先進的生物學(xué)應(yīng)用軟件。然而，要研發(fā)出新一代基因測序法，必須克服30年來以桑格技術(shù)為基礎(chǔ)的慣性思維。

      1977年，F(xiàn)red Sanger 和Alan R. Coulson發(fā)表了兩篇關(guān)于快速測序技術(shù)的論文[1,2]，該技術(shù)能夠破譯完整基因片斷和整個基因組，大大促進了生物學(xué)的發(fā)展。該技術(shù)是以Sanger 和Coulson發(fā)現(xiàn)的加減法原理（1975年）為基礎(chǔ)，大大減少了化學(xué)毒性物質(zhì)以及放射性同位素的處理，取代同年早期Maxam和Gilbert[3]發(fā)明的化學(xué)降解法成為近30年來唯一的DNA測序法[4]。

應(yīng)用桑格技術(shù)的哺乳動物基因組測序中心擁有工廠式全套設(shè)備以及大量工作人員。（圖片來源：Maria Nemenuk, Broad Institute）

      完成人類基因組計劃的終極目標(biāo)需要大量基因序列，這種需求推動了測序技術(shù)的發(fā)展，例如毛細(xì)血管電泳儀的出現(xiàn)。實驗自動化和程序并行化導(dǎo)致了一些擁有大規(guī)模測序設(shè)備與專家小組的測序中心出現(xiàn)。盡管目前已完成了兩個不同的人類基因組計劃，但是生物學(xué)家渴望知道更多的基因序列，更重要的是，他們希望有更經(jīng)濟的測序技術(shù)。

      2005年，介紹合成測序（sequencing-by-synthesis）方法（454生命科學(xué)公司研發(fā)[5]）以及自動測序軟件（George Church實驗室研發(fā)[6]）的劃時代性論文發(fā)表是測序市場創(chuàng)新的第一個標(biāo)志。這兩種測序技術(shù)應(yīng)用鉻鐵尖晶石板或者瓊脂糖薄板同時分析序列，與同期Sanger毛細(xì)管測序儀（極限為96個樣本）相比，具有以更小的反應(yīng)體積產(chǎn)生更多的序列數(shù)據(jù)的優(yōu)勢。

      454公司首推的測序儀能輕易的產(chǎn)生與50臺以上的全自動化3730XL毛細(xì)管測序儀（Applied Biosystem's 3730XL capillary sequencers）相當(dāng)?shù)男蛄袛?shù)據(jù)，成本花費卻只是后者的1/6左右。盡管如此，科學(xué)界對這項新技術(shù)卻并不熱衷。許多習(xí)慣用桑格技術(shù)的科學(xué)家懷疑新技術(shù)的準(zhǔn)確度、閱讀能力、成本消費、實用性。代理Sanger型測序硬件的經(jīng)銷商害怕其投資失敗而首先提出了這些懷疑。

      批評家為新測序技術(shù)的推廣設(shè)置了種種障礙，然而大多數(shù)人卻忽略了一個事實，即桑格技術(shù)的普及最初也遇到同樣的阻礙。桑格技術(shù)剛開發(fā)出來時，閱讀能力很難超過25bp，即使在Fred Sanger雙脫氧終止法發(fā)明后也只達(dá)到80bp，如今卻達(dá)到了750bp；而新發(fā)展的合成測序技術(shù)，應(yīng)用焦磷酸測序方法，其閱讀能力最初只有100bp，推向市場16個月后增加至250bp，隨著技術(shù)的不斷完善，目前已達(dá)到了400bp，很快就接近桑格技術(shù)目前的水平。

      除了閱讀能力外，能否以有限的成本用一臺儀器產(chǎn)生足夠數(shù)量的序列標(biāo)記也是另一個需要改善的重要問題。這個問題已經(jīng)被454公司解決了，應(yīng)用他們的系統(tǒng)，僅花費閱讀35bp或者更小片段的成本就能產(chǎn)生比35bp多10倍的序列標(biāo)記。當(dāng)今，搶灘新一代測序市場的儀器主要有三種：羅氏公司的454 GS FLX測序儀，Illumina公司的Solexa 1G測序儀和最新開發(fā)的全自動生化SOLiD系統(tǒng)，以及VisiGen公司和Helicos公司預(yù)期最近兩年內(nèi)推出的第三代（也叫新二代）單分子測序技術(shù)。

      盡管Margulies等人[5]應(yīng)用原理論證了應(yīng)用一臺或者兩臺儀器能分析中小型細(xì)菌基因組，但大多數(shù)人不相信應(yīng)用焦磷酸測序方法可以彌補桑格技術(shù)的不足。最初，羅氏454 GS20測序儀被用來對細(xì)菌基因組再測序或者為正在進行的龐大的“桑格工程”補充數(shù)據(jù)。這項工程初步階段需要做環(huán)境基因組學(xué)研究，不僅需要分析比人類基因組大得多的序列數(shù)據(jù)，而且要解決文庫構(gòu)建和克隆產(chǎn)生的取舍偏差等問題。這個時候，454技術(shù)利用乳滴PCR結(jié)合焦磷酸測序的優(yōu)勢迅速的打開了市場。乳滴PCR將單個DNA片段分子的擴增片段分配到一個乳滴中，從而提高了產(chǎn)物的純度。另一方面，焦磷酸測序利用計算機高通量檢測反應(yīng)中產(chǎn)生的光信號。2006年，早期研究公開證實了新一代測序儀的多功能性能夠為深礦的微生物[7]、深海中的稀有生物圈[8]或者海洋中的有毒微生物進行基因測序[9]。

      在2005年末，一個進行環(huán)境基因組學(xué)與古生物DNA研究[10]的科研小組僅用一臺羅氏（454）GS20測序儀就分析出了28,000年前長達(dá)13Mb的長毛象基因組[10]，從而為完成更有挑戰(zhàn)性的計劃——解密穴居人基因組鋪墊了道路[11,12]。解密古人類基因組比解密古象基因組更難，因為從可用的樣本中提取的穴居人DNA數(shù)量不到從現(xiàn)代人樣本中提取量的5%。因此，進行古人類基因組計劃需要比進行現(xiàn)代人基因計劃多20多倍的序列測定工作量。

      最新的新一代測序儀操作只需一個人，24小時內(nèi)可產(chǎn)生與幾百臺桑格毛細(xì)管測序儀同樣多的序列數(shù)據(jù)。

      此外，樣品中DNA損傷與常溫貯藏的狀態(tài)以及新一代測序誤差等因素往往超過了序列變異，因此很難確定樣品來源于現(xiàn)代人類還是古穴人。相比較而言，斷言長毛象的某一特定順序是來源于古代標(biāo)本，而不是現(xiàn)代污染物更容易，因為現(xiàn)代大象不像人類會經(jīng)常處在實驗室環(huán)境中。要在基因組范圍內(nèi)得到古代哺乳動物真正的序列，需要對某一區(qū)域進行反復(fù)的分析或者結(jié)合多種方法來確定其來源，這又要求大量削減成本來額外開展該項目。如果能完成這一項目而且能突破為復(fù)雜的多來源的DNA混合物測序的難題，將使測序地球上的任何生態(tài)系統(tǒng)成為可能，它也為測序至少十萬年前的古代動植物打開了一扇窗戶，這些都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了我們以前的預(yù)想。

      新一代測序儀已被用來再測序先前公布的參考細(xì)胞株，同時它也首次被允許查找基因組水平上的所有突變。在2005年，Velicer[14]等人首次從一種進化了1000代的結(jié)核分枝桿菌株[13]的基因組（9Mb）上發(fā)現(xiàn)了所有的突變體，同時也研究確定了該菌株上的耐藥性等位基因。從這些早期的成果中，人們清楚地看到，新技術(shù)雖然能發(fā)現(xiàn)新的基因突變[14]，但是它也必須解決許多測序中出現(xiàn)的錯誤，如焦磷酸測序時出現(xiàn)的同聚物干擾和閱讀短片段時3'端序列迅速降解等問題。

      初步的解決方法是聯(lián)合運用桑格和焦磷酸測序數(shù)據(jù)[15]。不管進行何種項目，只運用桑格技術(shù)，其人力和財力的消耗將是巨大的。許多實驗室現(xiàn)在要么只依靠新一代測序數(shù)據(jù)，要么結(jié)合焦磷酸測序法閱讀長片段與illumina的solexa低營運成本的優(yōu)勢，要么應(yīng)用生物系統(tǒng)的SOLiD平臺，獨自來考察各種體系的性能。隨著更多有效的非桑格測序方法的發(fā)明，現(xiàn)在已經(jīng)能評估新一代測序的準(zhǔn)確性和評估絕大多數(shù)公布的桑格數(shù)據(jù)的正確性。

      大量生產(chǎn)密切相關(guān)的有機體的序列數(shù)據(jù)推動了再測序的應(yīng)用。所謂再測序，就是以不同方式處理序列數(shù)據(jù)而不是重新組裝基因組。再測序以一個參考序列做對照，對目標(biāo)區(qū)域進行8-12次排序，排序次數(shù)比從頭組裝基因組（25-70次）少得多。

      研究表明用這種方法能夠測序10個哺乳動物線粒體基因組[16]，從而使群體遺傳學(xué)能夠建立在完整的線粒體基因組而不是短序列片段研究的基礎(chǔ)上。目前，許多微生物測序項目已在開展，這將不僅有利于擴大可用的基因組數(shù)據(jù)庫，而且還使許多在基因組水平上比較基因型和表現(xiàn)型的研究成為可能。

      甚至，研究目前尚未測序的生物體也能應(yīng)用新一代測序法，直接從序列水平上破譯細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄子。在許多方面，用基因序列來表示轉(zhuǎn)錄子的特性優(yōu)于用基因芯片表示。最重要的是，在排序前并不需要一定了解基因序列方面的知識，因為可以借助計算機比照數(shù)據(jù)庫中最接近的參考序列，從而得到轉(zhuǎn)錄子序列。因此，轉(zhuǎn)錄子序列的獲得將會給生命科學(xué)帶來革命性的進展。例如，參考豆科植物meticago truncatula時代的基因組和植物標(biāo)本Arabidopsis thaliana[17]，科學(xué)家能夠為Zea mays (玉米)[18]的cDNA排序，而且發(fā)現(xiàn)了大量以前未描述的序列標(biāo)簽。

      類似轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）方法可以避免巨大基因組所造成的問題。盡管桑格技術(shù)已經(jīng)成功完成病毒，微生物和大型哺乳動物的測序計劃，但還是留下一個問題——無法解析多倍體植物以及其后代的基因組。如小麥有16Gb的六倍體基因組，這些巨大的基因組，往往存在于農(nóng)作物中，僅利用舊測序法是無法得到其序列的。然而，應(yīng)用現(xiàn)在已證明的概念——新一代已表達(dá)序列標(biāo)志測序法花費低得多，就至少能在功能水平上對植物基因組進行評估[18]。

      最后，新一代測序法的應(yīng)用與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域密切相關(guān)。例如在癌癥遺傳學(xué)方面的應(yīng)用，對于某些情況下用桑格技術(shù)不能檢測的癌基因[19]，現(xiàn)在應(yīng)用超深測序法（ultra-deep sequencing）就可在組織中檢測到。當(dāng)桑格技術(shù)主要用來分析700bp以上的片段時，新一代測序法利用其閱讀片段短的特點，在測序領(lǐng)域得到重用。由于癌癥遺傳學(xué)不遵守孟德爾遺傳定律，激光捕獲顯微切割技術(shù)（laser-capture microdissection）用于收集相關(guān)等位基因而且必須使用PCR產(chǎn)物和/或擴增子序列定向，這樣避免了傳統(tǒng)的克隆及PCR誤差。

      雖然新一代測序儀已經(jīng)應(yīng)用于多項研究，但是有許多不足有待科學(xué)家與工程師們進一步改進。首先是降低成本：若要實現(xiàn)進行個人基因組研究的愿望，減少1-2個訂單的規(guī)模是必要的，個人的基因組再測序的目標(biāo)花費為1000美元。此外，降低測序錯誤率，這不僅是為了所有新一代測序技術(shù)的發(fā)展，而且還為了在不久的將來桑格測序技術(shù)能繼續(xù)被采用。今后可能會采用特定的DNA聚合酶發(fā)射光波的形式直接讀取DNA序列，但即使有了這些改進，我們還是不大可能看到DNA序列翻譯成機器可讀代碼。價格下降，數(shù)據(jù)量有可能會飛漲，這就會造成解析瓶頸。因此，大部分由未來新型測序儀器提供的數(shù)據(jù)增量，將抵消生物信息學(xué)方面增加的人力和財力消耗。

      在許多生命科學(xué)家認(rèn)為后基因組學(xué)研究已經(jīng)到來的時候，在短短不到兩年的時間里出版了1000多篇相關(guān)科研論文，新一代測序已顯示出巨大的潛力。它也使得基因組學(xué)返回到由單個科學(xué)家或小型科研單位來研究的方式，事實證明，大多數(shù)的新一代測序法論文來源于小型研究個體而非基因組中心。在不久的將來往回看，我們肯定會驚訝為什么最初新測序技術(shù)在科學(xué)界乃至商業(yè)界不受歡迎。當(dāng)?shù)谌�代的測序儀器被推廣的時候，我們可從中窺探到創(chuàng)新能打破桑格技術(shù)壟斷測序市場30多年的格局。

原文檢索：http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n1/full/nmeth1156.html

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