原理

DNA 以核蛋白形式存在于細(xì)胞核中，制備 DNA 的原則是既要將 DNA 與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持 DNA 分子的完整。蛋白酶K 及鏈霉蛋白酶 E 的應(yīng)用使這兩個原則得到了保證。

蛋白酶K 或鏈霉蛋白酶 E 均為廣譜蛋白酶，其重要特性是能在 SDS 和 EDTA 存在下保持很高的活性。在勻漿后提取 DNA 的反應(yīng)體系中， SDS 可破壞細(xì)咆膜、核膜，并使組織蛋白與 DNA 分子分離， EDTA 抑制細(xì)胞中 DNase 活性，蛋白酶 K 或鏈霉蛋白酶 E 將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使 DNA 分子完整地分離出來。再用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白質(zhì)，接著用氯仿抽提以除去 DNA 溶液中微量酚的污染。最后用無水乙醇沉淀 DNA 。為獲得高純度 DNA ，操作過程中常加入 RNase 除去 RNA 。獲得高分子量 DNA 的關(guān)鍵是防止 DNase 降解 DNA 。故標(biāo)本必須新鮮，在提取前細(xì)胞就保持完整，核、溶酶體等細(xì)胞器應(yīng)沒有明顯破壞，提取 DNA 用的離心管等器皿及試劑應(yīng)消毒。操作在4 ℃以下進(jìn)行。

操作

1 ．組織 DNA 的提取

1) 取小鼠新鮮肝組織，去除結(jié)締組織，用剪刀剪成細(xì)小碎塊

2) 加 10 倍體積 TE 緩沖液，用玻璃勻漿器在冰浴中中速勻漿

3) 將勻漿液轉(zhuǎn)入 10ml 離心管以 4000rpm 離心 10 分鐘，棄上清

4) 加 10 倍體積 TE 洗一遍，以 4000rpm 離心 10 分鐘，棄上清

5) 加適量 TE 稀釋

6) 取 400µl 稀釋液于 1.5ml 的 Eppendorf 管，緩慢加入 10 %SDS 溶液，至終濃度 0.5 %  ( 加 20µ1) ，搖勻直至溶液變粘稠

7) 加入 Rnase(200µg/m1) 至終濃度 20ug/m1(42µl) 混勻，置 37 ℃保溫 60 分鐘總體積   (420µ1) 。

8) 加蛋白酶 K(20mg/m1) 至終濃度 100ug/m1 混勻 ( 加 21u1) ，于 50 ℃保溫 3 小時，并間歇攪動 ( 總體積 441µ1) 。

9) 將此溶液冷卻至室溫，加等體積飽和酚抽提，以 10000rpm 離心 10 分鐘。

10) 取上清加 1/2 體積飽和酚， 1/2 體積氯仿／異戊醇抽提一次，以 10000rpm 離心 10 分鐘

11) 取上清，加等體積氯仿/異戊醇抽提一次，以 10000rpm 離心 10 分鐘

12) 加 1/10 體積 5MKAc ，加 2 倍體積無水乙醇充分混勻，以 12000rpm 離心 10 分鐘

13) 加 lml70 %乙醇洗沉淀，以 12000rpm 離心 10 分鐘

14) 待酒精揮發(fā)盡后加 20ul TE 溶解， 4 ℃儲存

2 ．電泳鑒定

取 DNA 樣品 2µ1 加上樣緩沖液 10µ1 ( 含溴酚藍(lán)指示劑和甘油 ) ，在 0.8 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行水平微型電泳，電壓 <5V/cm ，時間 2 小時左右。電泳后取出凝膠，用 0.5µg/ml 的溴化乙錠染色 20 分鐘，用紫外燈觀察分析。

試劑及器材

1 ．試劑

蛋白酶 K ：稱取 20mg 蛋白酶 K 溶于 lml 消毒雙蒸水中，－ 20 ℃?zhèn)溆谩?/P>

RNase( 牛胰 ) ：稱取 10mgRNase 溶于 lml 下列混合液中： 10mmol/l Tris-HCl ， pH8.0 ； lmmol/L EDTANa2 pH8.0 ； 50 %甘油。

10 %SDS 溶液：稱取 10gSDS 溶于 100ml 消毒雙蒸水中，于 65 ℃保溫 2 小時，貯存室溫備用。

1 × TE 緩沖液 (pH8.0) ： 10mmol/L Tris-HClpH8.0 ； lmmol/LEDTANa2 pH8.0 。配制后高壓滅菌， 4 ℃貯存。

1 × TE 飽和重蒸酚 (pH8.0)

氯仿/異戊醇 (24:1V/V)

10mol/LNH4 AC ，配制后高壓滅菌， 4 ℃貯存

無水乙醇 (AR)

70 %乙醇

2 ．器材

玻璃勻漿器；離心機(jī)；電泳儀；電泳槽；紫外透射反射分析儀。