文章編號(hào) ：1004-0374(2008)04-0000-06

小動(dòng)物體內(nèi)可見光三維成像技術(shù)研究進(jìn)展
楊華瑜1，韓　彧2，董洪瑩2，趙春林2*
(1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 北京協(xié)和醫(yī)院 肝臟外科， 北京 100730；
2 北京龍脈得- 冷泉港生物技術(shù)有限公司， 北京 100084)

摘　要：活體動(dòng)物體內(nèi)可見光成像是采用生物發(fā)光和熒光為標(biāo)記物，利用靈敏的儀器來監(jiān)控活體動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)、蛋白表達(dá)情況和基因行為。近年來，可見光成像在生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)方面得到了廣泛的應(yīng)用。隨著成像技術(shù)和檢測(cè)儀器的不斷發(fā)展，現(xiàn)已從平面二維成像逐漸發(fā)展為立體三維成像。 三維成像技術(shù)在靶點(diǎn)的空間定位、與器官的關(guān)系，及絕對(duì)定量方面都有了很大的進(jìn)展。 本文就三維成像技術(shù)的原理、應(yīng)用和發(fā)展前景進(jìn)行了簡(jiǎn)要的綜述。

關(guān)鍵詞：體內(nèi)光學(xué)成像；三維活體成像；生物發(fā)光；熒光；腫瘤轉(zhuǎn)移
中圖分類號(hào)：R445.1; Q631.11　　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Current developments of 3-D optical in vivo imaging technology in animal
YANG Hua-yu1, HAN Yu2, DONG Hong-ying2, ZHAO Chun-lin2*
(1Department of Liver Surgery, PUMCH, CAMS, Beijing 100730, China;
2Longmed, Inc/CS-Biotech, Inc., Beijing 100084, China)

Abstract: Bioluminescence and fluorescence have been proved to be a versatile and useful tool for animal in vivoimaging. Optical imaging employs sensitive instrument to monitor the activities of cell, protein and gene in vivo.It has been used widely in biomedical research and drug discoveries. With the recent development of the technology and instruments, the 2Dimentional imaging has developed to 3Dimential imaging in vivo. 3-D imaging will provide researchers not only detailed spatial information of the targets, its relationship with animal organs, but more quantitative results in vivo. This paper reviews of the current principles, developments and applications of the 3-D optical in vivo imaging technologies.

Key Words: animal imaging; in vivo optical imaging; 3-Dimentional bioluminescence; fluorescence; tumor
metastasis

活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像(optical in vivo imaging)主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)兩種技術(shù)標(biāo)記細(xì)胞、蛋白質(zhì)或DNA，利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器，直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)、蛋白表達(dá)情況和基因行為。通過這個(gè)系統(tǒng)，可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過程。傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法需要在不同的時(shí)間點(diǎn)宰殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相比之下，可見光體內(nèi)成像通過對(duì)同一組實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)(標(biāo)記細(xì)胞及基因)的移動(dòng)及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可信。另外, 這一技術(shù)最大的特點(diǎn)就是其極高的靈敏度，對(duì)腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)靈敏度極高，可以檢測(cè)到體內(nèi)幾百個(gè)標(biāo)記的細(xì)胞。并且，這個(gè)技術(shù)不涉及放射性物質(zhì)和方法, 非常安全。 因其操作極其簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn), 在剛剛發(fā)展起來的幾年時(shí)間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面[1-4]。僅僅近兩年在Nature和Science 雜志上就有四十多篇的論文在各個(gè)領(lǐng)域及各種方式應(yīng)用到了這個(gè)技術(shù)[5-8]，文獻(xiàn)[9,10]對(duì)該技術(shù)有詳細(xì)的介紹。

目前，活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)主要停留在二維成像基礎(chǔ)上，在實(shí)際應(yīng)用中面臨許多新的挑戰(zhàn)，例如，僅能確定發(fā)光信號(hào)在體內(nèi)的二維平面信息，無法確定發(fā)光信號(hào)位于體內(nèi)的深度，無法準(zhǔn)確定位發(fā)光信號(hào)與動(dòng)物器官的直接關(guān)系，即無法實(shí)現(xiàn)三維成像。光子在組織內(nèi)被吸收和分散；CCD 鏡頭采集到的信號(hào)強(qiáng)弱有賴于信號(hào)源的深度；僅僅憑借光的強(qiáng)度和其表面圖像無法判斷標(biāo)記物的絕對(duì)數(shù)量和其深度，因而出現(xiàn)使用二維成像技術(shù)所獲得的圖像中，動(dòng)物背側(cè)和腹側(cè)成像得到的結(jié)果有很大區(qū)別。最近一年來，這個(gè)技術(shù)最令人矚目的一項(xiàng)進(jìn)展就是從二維成像拓展到三維成像。本文就小動(dòng)物體內(nèi)可見光的三維成像技術(shù)的原理和應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的分析。

1　概述
三維成像對(duì)于二維成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)自然不必多說，一個(gè)非常接近的例子就是CT 與X-Ray 成像的區(qū)別。尤其當(dāng)利用可見光成像時(shí)，因?yàn)榭梢姽獯┩感缘南拗�，透過動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，又有不可避免的折射和散射，即使對(duì)同一只老鼠成像時(shí)，在腹部和背部成像的結(jié)果可能有很大的區(qū)別。沒有三維成像技術(shù)，很難對(duì)結(jié)果做出滿意的解釋(圖1)。


目前，對(duì)于動(dòng)物體內(nèi)可見光三維成像技術(shù)有兩個(gè)方向已經(jīng)得到實(shí)施，它們分別是多角度掃描技術(shù)和單角度三維成像技術(shù)。單角度三維成像技術(shù)又分為層析成像技術(shù)(diffuse luminescent image tomography,DLIT)和透視成像技術(shù)(fluorescence luminescent imagetomography，F(xiàn)LIT )。前者應(yīng)用于生物發(fā)光的三維成像；后者應(yīng)用于熒光的三維成像。

1.1　多角度掃描技術(shù)　多角度掃描技術(shù)是比較傳統(tǒng)的三維成像技術(shù), 也是研究人員比較熟悉的一個(gè)技術(shù)。該技術(shù)的原理與CT 及PET 等其他三維成像技術(shù)很類似。它對(duì)小鼠不同的角度進(jìn)行二維成像，然后將這些不同角度的二維圖像用軟件合成構(gòu)建成三維圖像(圖2)。


因?yàn)樯�物發(fā)光成像的檢測(cè)需要很靈敏的CCD鏡頭，其對(duì)環(huán)境溫度要求達(dá)到-90℃。利用這個(gè)原理的儀器往往CCD鏡頭是固定的，而將小動(dòng)物平臺(tái)環(huán)繞檢測(cè)鏡頭一周成像。 這種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是分辨率相對(duì)較高，原理簡(jiǎn)單，容易理解。 但是這種成像的時(shí)間要求較長(zhǎng)，需要20 － 30min。 并且，每次只能成像一只小鼠，在通量上有一定局限性。 這種技術(shù)在可見光成像中的應(yīng)用并不普遍，往往只是在利用其他高通量檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)到一個(gè)特別感興趣的小鼠后， 需要詳細(xì)研究時(shí)， 才采取這個(gè)技術(shù)。XENOGEN公司的IVIS 3D即采用此種技術(shù)進(jìn)行生物發(fā)光的三維成像。

1.2　單角度三維成像技術(shù)　單角度三維成像技術(shù)是相對(duì)于多角度掃描技術(shù)而命名的，是利用不同波長(zhǎng)的光對(duì)動(dòng)物組織的穿透性不同這一特性(例如紅光在體內(nèi)的穿透性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于綠光)。采用不同的濾光片在560 － 660nm獲得多個(gè)(至少二個(gè))波長(zhǎng)的圖像信息。舉個(gè)例子：綠光波長(zhǎng)較紅光波長(zhǎng)短，相對(duì)更難穿透組織。假設(shè)可見光標(biāo)記的靶點(diǎn)在體外發(fā)出的光中，綠光與紅光的強(qiáng)度是1:1，若得到的圖像中，綠光與紅光得到的信號(hào)強(qiáng)度接近1:1，則發(fā)光信號(hào)在體內(nèi)的位置很淺。 但是若得到的圖像中，綠光與紅光得到的信號(hào)強(qiáng)度為1:4 時(shí)，則證實(shí)發(fā)光信號(hào)在組織中所處的位置較深，這是因?yàn)榫G光的衰減遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于紅光。通過這種原理，在獲取這些信息后采用專門的重建算法，估算出靶點(diǎn)的深度，模擬出的三維圖像。此技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)是重建算法，常用的重建算法早已應(yīng)用在地球物理領(lǐng)域，用于地震檢測(cè)。盡管是通過算法重建估算出靶點(diǎn)深度，但所得數(shù)據(jù)仍是十分可靠的，其誤差可以控制在10% 以內(nèi)。體內(nèi)可見光層析成像技術(shù)，是由XENOGEN公司自主設(shè)計(jì)開發(fā)的，用于生物發(fā)光標(biāo)記的動(dòng)物，特別適合動(dòng)物組織的光學(xué)特性。模擬程度和真實(shí)解剖獲得的數(shù)值十分接近，在動(dòng)物成像領(lǐng)域?qū)儆陬I(lǐng)先地位，暫時(shí)無其他方法可達(dá)到此水平。測(cè)試時(shí)其首先使用結(jié)構(gòu)光源(structured light)獲得動(dòng)物表面拓?fù)鋱D像，得到動(dòng)物外表的三維成像。之后使用軟件控制濾鏡組的轉(zhuǎn)動(dòng)，在560 － 660nm 之間獲得不同波長(zhǎng)下的圖像，如圖3 所示，560nm時(shí)信號(hào)較弱；580nm時(shí)有所增加；600nm時(shí)信號(hào)最強(qiáng)，這是因?yàn)檩^長(zhǎng)波長(zhǎng)的光在動(dòng)物體內(nèi)的穿透性較強(qiáng)。標(biāo)記的靶點(diǎn)在體內(nèi)越深，短波長(zhǎng)的信號(hào)衰減越多，長(zhǎng)波長(zhǎng)的信號(hào)相對(duì)衰減較小。兩者強(qiáng)度的比例變化同標(biāo)記靶點(diǎn)在體內(nèi)的深度直接相關(guān)。根據(jù)不同波長(zhǎng)的光衰減的不同，通過軟件計(jì)算出靶點(diǎn)信號(hào)的深度，再結(jié)合表面拓?fù)鋱D像得到的小動(dòng)物形狀，構(gòu)建出小動(dòng)物體內(nèi)的三維圖像。擁有了靶點(diǎn)在動(dòng)物體內(nèi)的深度信息，就可以計(jì)算出信號(hào)在體內(nèi)的衰減。所以，這種方法得到的圖像不僅可以測(cè)量圖像中任意兩點(diǎn)之間的距離，還很好地解決了信號(hào)源深度的絕對(duì)定量問題。
這種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于可以快速、高通量地進(jìn)行三維成像， 是目前主要的可見光三維成像技術(shù)。XENOGEN 公司的IVIS 200 和IVIS Spectrum采用了此種技術(shù)進(jìn)行生物發(fā)光的三維成像。

熒光透視成像技術(shù)(fluorescence luminescent imagetomography，F(xiàn)LIT ) 又稱為穿透性熒光三維成像技術(shù)，采用激發(fā)光從小動(dòng)物底部激發(fā)，穿透小動(dòng)物后，使用不同波長(zhǎng)的濾光鏡從小動(dòng)物的上部進(jìn)行光譜采集。這一方式不僅有效地避免了動(dòng)物皮毛和其他一般組織所產(chǎn)生的非特異性背景熒光對(duì)結(jié)果的干擾，并且能夠得到熒光標(biāo)記靶點(diǎn)的體內(nèi)深度信息。進(jìn)行測(cè)量時(shí)首先還是利用結(jié)構(gòu)光源(structured light)獲得動(dòng)物拓?fù)浔砻鎴D像，之后利用軟件選擇動(dòng)
物底部的幾個(gè)特定點(diǎn)作為穿透性激發(fā)光源，使用不同波長(zhǎng)的濾光片進(jìn)行發(fā)射光信號(hào)的采集。根據(jù)不同激發(fā)光源位置所得的光譜不同，擴(kuò)散的大小和方位，以及光強(qiáng)的變化，利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)動(dòng)物模型的模擬結(jié)果，確定出信號(hào)源在動(dòng)物體內(nèi)的深度信息。結(jié)合拓?fù)浔砻鎴D像，利用軟件模擬出小動(dòng)物體內(nèi)熒光標(biāo)記物的三維成像圖( 圖4) 。目前，只有XENOGEN公司的IVIS Spectrum采用了此種技術(shù)進(jìn)行熒光的三維成像。



2　三維成像結(jié)果與動(dòng)物器官的關(guān)系
通過DLIT 和FLIT技術(shù)可以獲得動(dòng)物生物發(fā)光和熒光的三維成像圖，這一結(jié)果是基于和拓?fù)浔砻鎴D像結(jié)合的結(jié)果，并沒有與動(dòng)物體內(nèi)的器官建立相對(duì)應(yīng)的關(guān)聯(lián)。為了能夠更準(zhǔn)確地定位信號(hào)源在體內(nèi)所在的器官，使用不同斷層的病理切片和小鼠不同姿勢(shì)的CT 圖譜，建立了數(shù)字化的小鼠器官圖�？梢詫⒂�(jì)算好的三維成像圖與器官圖進(jìn)行擬合，用以確定信號(hào)所在的器官位置(圖5)。這種方法的局限在于所有的三維成像圖都和相同的數(shù)字器官圖擬合，僅在動(dòng)物體表面積上有所變化。隨著軟件的進(jìn)一步發(fā)展，可以把三維成像圖與真實(shí)老鼠的CT、MRI 所獲得結(jié)構(gòu)性成像疊加，獲得特異性更強(qiáng)的結(jié)果。XENOGEN 公司的IVIS 200 及IVIS Spectrum采用了此種方法進(jìn)行三維成像圖和器官圖的擬合。


3　三維成像在生物學(xué)及醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用二維活體光學(xué)成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，但是信號(hào)的強(qiáng)度、準(zhǔn)確的定量以及信號(hào)源的強(qiáng)深度都無法通過二維成像得到解決。伴隨著三維成像技術(shù)的發(fā)展，困擾科研工作者的難題都將迎刃而解，三維成像技術(shù)也將越來越多地應(yīng)用到廣闊的領(lǐng)域中，包括腫瘤微轉(zhuǎn)移研[11]、流體細(xì)胞(干細(xì)胞、T 細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)研究[12]、基因表達(dá)研究[13]、病毒和細(xì)菌的研究[14]、大分子體內(nèi)分布和運(yùn)動(dòng)等方面。

腫瘤轉(zhuǎn)移是抗腫瘤研究的一大熱點(diǎn)，光學(xué)活體成像技術(shù)的發(fā)展將其研究推向了新的層面。在使用二維成像技術(shù)時(shí)僅能得到簡(jiǎn)單的信號(hào)面積圖像和相應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度。在使用三維成像技術(shù)后，可以得到轉(zhuǎn)移灶所在的準(zhǔn)確深度，與器官相應(yīng)位置結(jié)合后可以確定轉(zhuǎn)移灶的實(shí)際方位，使整個(gè)研究更具意義。與此同時(shí)，由于得到了信號(hào)強(qiáng)度的數(shù)據(jù)，可以據(jù)此推算出信號(hào)衰減的情況，經(jīng)過計(jì)算后可以得到精確的信號(hào)源深度，以此得出確切的腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)。這一特點(diǎn)可以使得抗腫瘤及抗轉(zhuǎn)移藥物的藥效評(píng)價(jià)更加準(zhǔn)確。在免疫學(xué)研究中，可以通過活體成像技術(shù)準(zhǔn)確的跟蹤目的細(xì)胞(干細(xì)胞、T 細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)在體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)規(guī)律，或者評(píng)價(jià)應(yīng)用免疫細(xì)胞進(jìn)行生物治療后的確切療效。三維成像技術(shù)的準(zhǔn)確定量功能可以使這些研究得到的結(jié)果更具有實(shí)際價(jià)值。同樣也可對(duì)標(biāo)記有報(bào)告基因的微生物(如腺病毒，細(xì)菌等)進(jìn)行示蹤，了解它們?cè)隗w內(nèi)傳播的規(guī)律以及藥物對(duì)它們的作用。還可以應(yīng)用三維成像技術(shù)研究體內(nèi)大分子(如Ig G、各種蛋白分子等)的運(yùn)動(dòng)及其相互作用，能夠獲得比二維成像更多的信息，為很多基礎(chǔ)研究提供了良好的事實(shí)依據(jù)和驗(yàn)證平臺(tái)�？偠�言之，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和活體成像儀的使用，可見光活體成像技術(shù)在腫瘤研究、免疫研究、傳染病研究等醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)�扮演更加重要的角色，可見光三維成像技術(shù)作為一種新的成像方法，可以對(duì)待測(cè)對(duì)象進(jìn)行功能性的定位和定量的評(píng)價(jià)。隨著這一技術(shù)的不斷發(fā)展，會(huì)進(jìn)一步突破技術(shù)上的難題 (例如確定信號(hào)源的形狀)，這將為科研工作者提供巨大的幫助。

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冷泉港/龍脈得生物技術(shù)有限公司 趙春林 供稿
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