一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1． 標(biāo)本制備：
2． 最小化非特異性結(jié)合：
二、凋亡
1．凋亡的檢測(cè)方法：網(wǎng)站和其它
2．PI染色法
3．Annexin V 法
4．TUNNEL法
三、細(xì)胞因子
1．激活的細(xì)胞因子
2．CBA
四、血小板
1．活化
2．活化檢測(cè)
3．網(wǎng)織血小板
五、紅細(xì)胞
1．網(wǎng)織紅細(xì)胞
2．PNH
3．胎兒紅細(xì)胞
六、腫瘤學(xué)
1．DNA 細(xì)胞周期
2．蛋白
3．多藥耐藥
4．微小殘留白血病

第一部分 標(biāo)本處理

一、流式細(xì)胞術(shù)常規(guī)檢測(cè)時(shí)的樣品制備
(一)直接免疫熒光標(biāo)記法
取一定量細(xì)胞(約1X106細(xì)胞／ml)，在每一管中分別加入50μl的HAB，并充分混勻，于室溫中靜置1分鐘以上(),再直接加入連接有熒光素的抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)(如做雙標(biāo)或多標(biāo)染色，可把幾種標(biāo)記有不同熒光素的抗體同時(shí)加入)，。孵育20-60分鐘后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入緩沖液重懸，上機(jī)檢測(cè)。本方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，易于分析，適用于同一細(xì)胞群多參數(shù)同時(shí)測(cè)定。雖然直標(biāo)抗體試劑成本較高，但減少了間接標(biāo)記法中較強(qiáng)的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標(biāo)本的檢測(cè)。
(二)間接免疫熒光標(biāo)記法
取一定量的細(xì)胞懸液(約1X106細(xì)胞／ml)，先加入特異的第一抗體，待反應(yīng)完全后洗去未結(jié)合抗體，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體，生成抗原—抗體—抗抗體復(fù)合物，以FCM檢測(cè)其上標(biāo)記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的熒光。本方法費(fèi)用較低，二抗應(yīng)用廣泛，多用于科研標(biāo)本的檢測(cè)。但由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強(qiáng)，易影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所以標(biāo)本制備時(shí)應(yīng)加入陰性或陽(yáng)性對(duì)照。另外，由于間標(biāo)法步驟較多，增加了細(xì)胞的丟失，不適用測(cè)定細(xì)胞數(shù)較少的標(biāo)本。

二、最小化非特異性結(jié)合的方法
1．熒光標(biāo)記的抗體的濃度應(yīng)該合適，如果濃度過(guò)高，背景會(huì)因?yàn)榉翘禺愋缘南嗷プ饔玫脑黾佣�增加�?br> 2．在使用第一抗體之前，將樣品與過(guò)量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脫脂干奶酪，或來(lái)自于同一寄主的正常血清來(lái)作為標(biāo)記的第二抗體。這個(gè)步驟通過(guò)阻斷第一抗體和細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的非特異性的交互作用來(lái)降低背景。
3．在使用第一抗體之后，將樣品與5%至10%的來(lái)自于同一寄主的正常血清和作為標(biāo)記的第二抗體一起培育。這個(gè)步驟會(huì)減少不必要的第二抗體與第一抗體、細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的交互作用。
通過(guò)用來(lái)自于同樣的樣品的血清稀釋標(biāo)記過(guò)的抗體可以略過(guò)此步驟。此步驟適用于很多方面，但有時(shí)候它也會(huì)導(dǎo)致已標(biāo)記的第二抗體和正常血清中的免疫球蛋白的免疫復(fù)合體的形成。這種復(fù)合體會(huì)優(yōu)先與一些細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)合，或者它們最終會(huì)導(dǎo)致期望得到的抗體活性的丟失。
4．使用F(ab’)2片段會(huì)使背景決定于第一或第二抗體與FC受體的全分子結(jié)合。大多數(shù)的第二抗體的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗體的F(ab’)2片段一般是不能利用或很難制作。因此，在NaN3存在的條件下，將新鮮組織或細(xì)胞與正常血清一起培育應(yīng)選擇優(yōu)先加入第一抗體。在此情況下，即使在隨后的步驟中用完所有的抗體分子，F(xiàn)C受體決定的背景影響已不再重要。
5．其它：已標(biāo)記的抗體和其他一些內(nèi)在的免疫球蛋白或加入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的其它物質(zhì)的交叉反應(yīng)也可能會(huì)有背景影響。為了降低背景，在多重標(biāo)記過(guò)程中，所有的已標(biāo)記的抗體應(yīng)被吸附，避免其他種類蛋白的交叉反應(yīng)。


第二部分 細(xì)胞因子

細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

一、簡(jiǎn)介
隨著研究的進(jìn)展，僅僅對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定量和活性的檢測(cè)已不能滿足需要。在單細(xì)胞水平研究細(xì)胞因子的表達(dá)能力對(duì)研究細(xì)胞因子在疾病中的作用越來(lái)越顯的重要無(wú)比。目前檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞特定細(xì)胞因子的表達(dá)手段包括：ELIspot、原位雜交、免疫細(xì)胞化學(xué)、限制性稀釋分析（limiting dilution analysis，LDA）和單細(xì)胞PCR，應(yīng)用原位雜交技術(shù)和免疫組化方法觀察細(xì)胞因子蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)可以識(shí)別Th1和Th2細(xì)胞，此方法可獲得較強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，但此方法工作量大、主觀性強(qiáng)，難以進(jìn)行大樣本檢測(cè)，且人肉眼識(shí)別能力有很大的局限性，而ELISPOT及單細(xì)胞PCR技術(shù)，技術(shù)性強(qiáng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大，難以進(jìn)行廣泛推廣。隨著多標(biāo)記及胞內(nèi)細(xì)胞因子標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)，使對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的研究推向了一個(gè)新的階段。下面主要對(duì)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式細(xì)胞技術(shù)作以介紹。
　　早期細(xì)胞因子表達(dá)與細(xì)胞功能相關(guān)性研究是基于特定克隆細(xì)胞的激活。盡管研究應(yīng)用T淋巴細(xì)胞克隆證明了不同細(xì)胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－)與TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但這些研究很難外推，因?yàn)門(mén)細(xì)胞克隆與體內(nèi)T細(xì)胞功能相關(guān)性還未被揭示。
近來(lái)，Jung與Picker采用了monensin、PMA等藥物預(yù)孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻斷了胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)的方法使得細(xì)胞因子聚集，蓄積，增強(qiáng)細(xì)胞因子信號(hào)可被流式細(xì)胞儀檢測(cè)。因?yàn)樽匀粻顟B(tài)下，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生少量的細(xì)胞因子，通常要對(duì)T淋巴細(xì)胞體外活化進(jìn)行研究。在體外刺激過(guò)程中，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子已釋放出來(lái)，胞內(nèi)細(xì)胞因子信號(hào)較弱，難以進(jìn)行檢測(cè)。這一方法可檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)細(xì)胞因子，并可區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群。在細(xì)胞水平該方法證明了人與鼠的淋巴細(xì)胞都存在1型與2型分化，且這些分化在特定細(xì)胞因子增強(qiáng)時(shí)可被逆轉(zhuǎn)。且這些研究清楚地證明，只有激活的細(xì)胞亞群可以表達(dá)細(xì)胞因子，靜止的正常淋巴細(xì)胞(T、B、NK)不能分泌細(xì)胞因子。
胞內(nèi)流式分析法是用抗細(xì)胞因子抗體與細(xì)胞表面或胞內(nèi)特定亞群標(biāo)志組合，即可檢測(cè)不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的分泌，同時(shí)采用特殊的化學(xué)與抗體選擇，確保靜止與無(wú)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的最小熒光背景。具有其它方法難以比擬的優(yōu)點(diǎn)：
Ø 快速：流式定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子可在一天內(nèi)完成，實(shí)驗(yàn)流程需6-8小時(shí)，實(shí)際操作時(shí)間為1-2小時(shí)，快速簡(jiǎn)便；
Ø 簡(jiǎn)便：無(wú)需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無(wú)需分離PBMCs；
Ø 靈敏度高：高度靈敏的熒光標(biāo)記與檢測(cè)系統(tǒng)；
Ø 高效：可以在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)檢測(cè)兩種或更多種細(xì)胞因子，也可根據(jù)細(xì)胞免疫表型區(qū)分分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞的亞型，進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)分析；
Ø 安全：減少樣本處理與生物源性污染
Ø 接近生物體的分析條件：全血檢測(cè)保留細(xì)胞及生化微環(huán)境更準(zhǔn)確反映了體內(nèi)狀況。

二、所需儀器
1.流式上樣管及細(xì)胞培養(yǎng)皿或板
2.25%CO2，37℃孵箱
3. 混勻振蕩器
4.離心機(jī)
5.加樣器、Tips
6.流式細(xì)胞儀

三、常用的標(biāo)本類型和處理方法
全血：使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素鋰、EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時(shí)內(nèi)分析，超過(guò)8小時(shí)會(huì)導(dǎo)致活性的損失，一般細(xì)胞因子陽(yáng)性細(xì)胞會(huì)減少5%。如不能在8小時(shí)之內(nèi)檢測(cè)，應(yīng)將真空采血管水平室溫放置。
自身血漿中外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)：使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs，24小時(shí)內(nèi)分析。
組織培養(yǎng)基中的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)：用Ficoll分離PBMCs，將細(xì)胞重懸于含10%熱滅活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×106細(xì)胞/ml。
細(xì)胞系與T細(xì)胞克�。赫{(diào)節(jié)細(xì)胞濃度2×106細(xì)胞/mL于新鮮培養(yǎng)基中。
冰凍全血與PBMCs：使用1×紅細(xì)胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重懸，－70℃凍存。溶化后細(xì)胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，離心5分鐘后，用破膜劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破膜和染色。

四、所需試劑
1、細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑
依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇特殊表面標(biāo)志
CD45圈定所有淋巴細(xì)胞
CD3 圈定T淋巴細(xì)胞
CD4 圈定T輔助淋巴細(xì)胞亞群
CD8 圈定T抑制淋巴細(xì)胞亞群
CD19/或CD20圈定B淋巴細(xì)胞
CD56圈定NK淋巴細(xì)胞
CD14圈定單核細(xì)胞
2、熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體：R&D提供FITC、PE和APC標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體
3、溶血素：用外周全血檢測(cè)時(shí)需使用溶血素（R&D目錄號(hào)WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目錄號(hào)00-4333）溶解紅細(xì)胞
4、激活劑
①Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)（Alexis，目錄號(hào)ALX-445-004-M001）
A.DMSO中調(diào)節(jié)濃度0.1mg/mL
B.分裝(20L)，－20℃儲(chǔ)存。勿反復(fù)凍融
C.每次實(shí)驗(yàn)用無(wú)菌無(wú)疊氮鈉PBS 1：100稀釋儲(chǔ)存液
D.PMA終濃度25ng/mL細(xì)胞懸液
②Ionomycin （Alexis,目錄號(hào)ALX-450-006-M001）
A.于乙醇中配制成濃度0.5mg/mL
B.－20℃儲(chǔ)存
C.每次實(shí)驗(yàn)用無(wú)菌無(wú)疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲(chǔ)存液
D.Ionomycin終濃度1g/mL細(xì)胞懸液
③ Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)
A.無(wú)菌無(wú)疊氮鈉PBS調(diào)節(jié)濃度0.5mg/mL
B.4℃儲(chǔ)存
C.SEB終濃度10g/mL細(xì)胞懸液
④CD3：包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑存在下活化未稀釋的血液細(xì)胞
⑤CD28：加速不同刺激劑（包括SEB、CD3等）的活化效應(yīng)，濃度一般為10ug/ml
5、阻斷劑
阻斷高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)作用，使得刺激細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子聚集在胞漿內(nèi)
① Brefeldin-A(BFA) （eBioscience，目錄號(hào)00-4506）
A. 于DMSO中調(diào)節(jié)濃度5mg/mL
B. 分裝(20L)，-20℃儲(chǔ)存。勿反復(fù)凍融。
C. 每次實(shí)驗(yàn)用無(wú)菌無(wú)疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲(chǔ)存液
D. 激活最后4－5小時(shí)BFA終濃度10g/mL細(xì)胞懸液。
注意：BFA過(guò)度孵育會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降
② Monensin （eBioscience，目錄號(hào)00-4505）
6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640
7、 固定劑：細(xì)胞在體外刺激后需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。固定的目的在于通過(guò)蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細(xì)胞因子固定在細(xì)胞內(nèi)，另一方面避免細(xì)胞表面抗原丟失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目錄號(hào)00-8222）
8、 破膜劑：含1％皂甙、0.05％疊氮化鈉的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目錄號(hào)00-8333）
將細(xì)胞膜穿孔，已利于熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，于相應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合
9、其它試劑：無(wú)菌無(wú)疊氮鈉PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃儲(chǔ)存。

五、細(xì)胞培養(yǎng)和刺激的基本方法
細(xì)胞活化的最終結(jié)果是產(chǎn)生細(xì)胞因子，根據(jù)檢測(cè)指標(biāo)和標(biāo)本的不同，研究人員需要選擇不同的刺激劑和刺激時(shí)間，以獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。下表提供了檢測(cè)一些常用細(xì)胞因子的推薦的活化方法。

表1、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式檢測(cè)推薦的陽(yáng)性對(duì)照活化方法

為防止細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分泌到胞外，在培養(yǎng)的最后4-6個(gè)小時(shí)，需要使用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑 (如3uM monensin，10mg/ml的BFA)
方法1: 只使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)
方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小時(shí).
方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小時(shí).
方法4: 人的PBMCs或者純化的CD4＋細(xì)胞在包被人CD3抗體的培養(yǎng)板中，使用含有重組人的IL-2（10 ng/ml，目錄號(hào)202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目錄號(hào)204-IL-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；細(xì)胞洗滌后在含有重組人IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2天；最后收獲細(xì)胞，使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小時(shí)
方法5: CD4+ T 細(xì)胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days
方法6: T 細(xì)胞使用抗CD3 的單抗、抗CD28的單抗和重組人的IL-1b (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)
方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激
方法8: PBMCs細(xì)胞使用重組人IFN (10 ng/ml，目錄號(hào)285-IF-100) 刺激2 小時(shí)，然后使用IFN (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小時(shí)或者使用相同的方法刺激THP-1 細(xì)胞.
方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗體(25 ug/ml) 的培養(yǎng)板中，使用抗CD28 抗體(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小時(shí)
方法10: CD4＋T細(xì)胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗體的培養(yǎng)板中，使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗體，重組小鼠的IL-2（10 ng/ml，目錄號(hào)402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目錄號(hào)404-ML-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；然后在含有重組小鼠IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3天；最后收獲細(xì)胞，使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小時(shí)。
方法11: 小鼠ip巨噬細(xì)胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小時(shí)
方法12: 小鼠脾細(xì)胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小時(shí)