生物芯片概論

DNA分子在大多數(shù)生物體中是以雙股的型態(tài)存在(少數(shù)病毒、噬菌體除外)。在某些特殊生理狀態(tài)下，例如：細(xì)胞分裂、基因表現(xiàn)等，雙股DNA會(huì)解開(kāi)變成單股，然后再回復(fù)成雙股。而生物學(xué)家很早就把這單股DNA利用氫鍵結(jié)合成雙股DNA分子的特性應(yīng)用在生物相關(guān)的研究，稱之為雜合反應(yīng)(Hybridization)。從1965年，Gillespie和piegelman發(fā)表利用雜合反應(yīng)篩選重組菌株后，有許多的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括南方墨點(diǎn)(Southern blot)、北方墨點(diǎn)(Northern blot)、原位雜合(in situ Hybridization)、DNA序列分析(DNA Sequencing)、PCR (Polymerase Chain Reaction) 甚至目前熱門(mén)的生物芯片(DNA芯片)，無(wú)一不是利用核酸雜合反應(yīng)的原理。從這個(gè)歷史的演進(jìn)，也可看出生物芯片在基因體研究上的多元潛力。

生物芯片是先將已知有興趣的單股DNA分子，稱為探針DNA (probe DNA)，利用化學(xué)共價(jià)結(jié)合或物理性吸附，固定在耐侖膜(nylon membrane)、玻璃或其它固態(tài)載體上。再利用一些實(shí)驗(yàn)技術(shù)從細(xì)胞或細(xì)菌復(fù)制、放大有興趣的基因或DNA片段，稱之為標(biāo)的DNA(target DNA)，并以熒光物質(zhì)標(biāo)定(label)。標(biāo)的DNA和芯片上的探針DNA進(jìn)行雜合反應(yīng)后，若此細(xì)胞或細(xì)菌有表現(xiàn)植入芯片上的基因或DNA片段，就可在掃描儀上偵測(cè)到熒光亮點(diǎn)，我們就可以知道哪些基因有表現(xiàn)，哪些基因沒(méi)有表現(xiàn)。從植入芯片上的探針DNA不同，可以分成兩大類(lèi)：一類(lèi)是將單股cDNA
(complementary DNA)植入芯片，稱為cDNA芯片；另一類(lèi)是把寡核甘酸序列(oligonucleotide)植入芯片，稱之為寡核甘酸芯片(oligo chip)。這兩類(lèi)生物芯片性質(zhì)不同，適用于不同的基因體研究，并且擴(kuò)展了生物芯片應(yīng)用的范圍。

生物芯片在基因體研究上的應(yīng)用

微小化并能同時(shí)快速大量的處理樣品是生物芯片最大的優(yōu)點(diǎn)，目前應(yīng)用生物芯片研究的領(lǐng)域很廣，如：基因表現(xiàn)、發(fā)現(xiàn)新基因、癌癥分類(lèi)、新藥開(kāi)發(fā)、單一核甘酸多型性(SNP, single nucleotide polymorphism)等。

1.基因表現(xiàn)

在生物芯片發(fā)展之前，大部分的研究者都僅局限在研究一個(gè)或數(shù)個(gè)基因的表現(xiàn)，這對(duì)于復(fù)雜的生物系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，無(wú)異是以管窺天。利用生物芯片，我們可以同時(shí)監(jiān)看上百種甚至上千種基因的表現(xiàn)。Affymetrix公司所推出Human
Genome U95 Set 包含了6000個(gè)以上的人類(lèi)基因和EST片段，幾乎含蓋了所有人類(lèi)的基因，利用此種生物芯片，可使我們對(duì)于生物體整個(gè)反應(yīng)機(jī)制及訊號(hào)傳遞(signal transduction)有較完整的了解。

以癌癥為例，癌癥一直是人類(lèi)十大死因之首。對(duì)于生物學(xué)家而言，它也是一個(gè)有趣而復(fù)雜的課題，為什么有些人會(huì)得癌癥？有些不會(huì)？是什么原因造成一個(gè)正常細(xì)胞開(kāi)始毫無(wú)約束的不斷分裂？雖然目前已找到一些抑癌基因(tumor suppressor gene)和致癌基因(oncogene)。但癌癥是由許多因素加在一起所造成的結(jié)果，我們很難斷定什么致癌物一定會(huì)引起癌癥，由于它牽涉許多基因的交互作用，因此至今連發(fā)生的原因都不甚明了，更遑論治療了。生物芯片提供了一個(gè)很好的工具，告訴我們癌細(xì)胞和一個(gè)正常細(xì)胞到底有何不同。如我們從正常細(xì)胞抽取其mRNA(messenger RNA)以反轉(zhuǎn)錄脢(reverse transcriptase)制造其互補(bǔ)DNA(cDNA)并用綠色熒光物質(zhì)標(biāo)定；同樣地，從癌細(xì)胞抽出之mRNA制造其cDNA后，以紅色熒光物質(zhì)標(biāo)定，將此兩種標(biāo)的DNA(此指cDNA)混合在同一芯片上做雜合反應(yīng)，正常細(xì)胞表現(xiàn)較多的基因呈現(xiàn)綠點(diǎn)，而癌細(xì)胞表現(xiàn)較多的基因呈現(xiàn)紅點(diǎn)，正常細(xì)胞和癌細(xì)胞表現(xiàn)相同的基因則呈現(xiàn)黃點(diǎn)。由此即可知道哪些基因在癌細(xì)胞中大量表現(xiàn)。此例中，ErbB2基因呈現(xiàn)紅點(diǎn)，表示在乳癌細(xì)胞中此基因大量表現(xiàn)。

利用此種方法可應(yīng)用在其它各種不同的研究領(lǐng)域，例如：Lockhart利用含有65000個(gè)寡核甘酸探針的生物芯片，分析老鼠T細(xì)胞中114個(gè)基因。發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞激素(cytokine)的誘導(dǎo)下，有20種基因表現(xiàn)受到影響。Kevin等人利用6240個(gè)不同基因和EST片段的生物芯片，研究和果蠅蛻變(metamorphosis)有關(guān)的基因。Joseph利用含有6400個(gè)DNA片段的生物芯片，研究酵母菌從呼吸作用轉(zhuǎn)變成發(fā)酵作用其中有關(guān)代謝的基因表現(xiàn)，當(dāng)葡萄糖在培養(yǎng)液中逐漸減少時(shí)，大約有710個(gè)基因被誘發(fā)表現(xiàn)，1030個(gè)基因產(chǎn)物減少。

2.新基因的發(fā)現(xiàn)

由上可知，不論是癌細(xì)胞的表現(xiàn)、刺激T細(xì)胞的反應(yīng)、果蠅發(fā)育、或是代謝途徑的改變。這些生理現(xiàn)象都被復(fù)雜的基因所調(diào)控，牽涉到許多基因。以人類(lèi)約有100000個(gè)基因來(lái)估算，我們知道其功能的基因不及5％，而真正知道其作用機(jī)制的，更是屈指可數(shù)。點(diǎn)在芯片上的探針DNA，有很多是我們還不清楚功能的，但當(dāng)我們?nèi)タ凑麄�(gè)細(xì)胞的基因表現(xiàn)時(shí)，我們就可對(duì)那些功能不明，但被促進(jìn)表現(xiàn)或抑制表現(xiàn)的一些基因做深入的研究，并推測(cè)它是參與那一條訊號(hào)傳遞路徑(pathway)。以Joseph研究酵母菌代謝的實(shí)驗(yàn)為例，就發(fā)現(xiàn)了超過(guò)400個(gè)新的基因作用其中。

3.癌癥的分類(lèi)

傳統(tǒng)上，病理學(xué)家依腫瘤的型態(tài)學(xué)加以分類(lèi)，但此種分類(lèi)法對(duì)于那些組織病理學(xué)相似，但病程和愈后迥異的癌癥無(wú)法有效地區(qū)分�，F(xiàn)在科學(xué)家可利用生物芯片來(lái)分類(lèi)癌癥，分子診斷不但能準(zhǔn)確地區(qū)分相似的癌癥，同時(shí)也讓我們對(duì)于腫瘤的分子機(jī)制有更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

Golub在1999年科學(xué)雜志(Science)發(fā)表利用生物芯片來(lái)區(qū)分Acute Myeloid Leukemia(AML)和Acute
Lymphoblastic Leukemia (ALL)。這兩種血癌(Leukemia)在顯微鏡下型態(tài)很相似，但卻需要完全不同的化學(xué)療程。首先他們用6800個(gè)基因的芯片檢視38個(gè)病人(其中27個(gè)被診斷為ALL而另11人則為AML)，然后鎖定了其中50個(gè)基因，這些基因包括了細(xì)胞表面抗原(cell surface antigen)、細(xì)胞周期蛋白(cell cycle protein)、細(xì)胞聯(lián)系蛋白(cell adhesion protein)和一些酵素。這50個(gè)基因明顯地在AML和ALL中表現(xiàn)不同 。因此可用以區(qū)分AML和ALL。以生物芯片檢測(cè)癌癥不但是在癌癥診斷學(xué)上的重大突破，同時(shí)也對(duì)癌癥治療、抑癌藥物的開(kāi)發(fā)等有重大的影響。

4.新藥開(kāi)發(fā)

開(kāi)發(fā)新藥的一般策略是找到和疾病有專一性的細(xì)胞標(biāo)的物(通常是蛋白質(zhì))，然后再篩選能抑制或競(jìng)爭(zhēng)此蛋白質(zhì)的分子—可能是蛋白質(zhì)、核酸或是有機(jī)化合物等。然而這個(gè)方法受限于只能篩選已知的細(xì)胞標(biāo)的物，而生物芯片可以加速確認(rèn)疾病的專一性細(xì)胞標(biāo)的物，并顯示其病理學(xué)的作用途徑。這些發(fā)現(xiàn)均能立即用在新藥的開(kāi)發(fā)上。例如：Her-2/neu在乳癌細(xì)胞中大量表現(xiàn)，它就有潛力成為新藥的標(biāo)的物，換句話說(shuō)，我們可以找一些抑制Her-2/neu表現(xiàn)的分子—即為新藥。此外，開(kāi)發(fā)中的新藥也可利用生物芯片來(lái)了解它的作用機(jī)制。


5.單一核甘酸多型性(SNP)

雖然同種生物其染色體差異極小，但平均1000個(gè)堿基對(duì) (base pair)就有一個(gè)發(fā)生突變，這些變異稱為SNP，是造成每個(gè)人對(duì)藥物的敏感性不同、血型不同等的原因。此外，SNP也和癌癥、心血管疾病、自體免疫、糖尿病及阿茲罕默癥等疾病有關(guān)，甚至于微生物的抗藥性。所以SNP現(xiàn)在越來(lái)越受到重視，SNP協(xié)會(huì)，TSC (The SNP Consortium)，于1999年4月打算花4,500萬(wàn)美金在兩年內(nèi)找出300,000種SNP，并建立數(shù)據(jù)庫(kù)。

最近很多研究者想利用高密度的生物芯片來(lái)鑒別人類(lèi)的SNP，Patrick等人則利用可通電流的半導(dǎo)體生物芯片來(lái)分辨人類(lèi)甘露醣結(jié)合蛋白(Human Mannose Binding Protein，MBP)的SNP。MBP對(duì)于先天性免疫系統(tǒng)很重要，尤其是對(duì)于那些尚未發(fā)育完整免疫系統(tǒng)的兒童。此外，Affymetrix公司也發(fā)展出p53 GeneChip，藉由設(shè)計(jì)一組含5種不同堿基序列的探針DNA，它能偵測(cè)出腫瘤抑制基因p53在特殊區(qū)域中，堿基序列的SNP(出現(xiàn)A或G)，如圖3.；HIV GeneChip則能偵測(cè)出HIV-1 Protease的變異。

未來(lái)21世紀(jì)最重要的生醫(yī)研究工具

由美國(guó)主導(dǎo)的人類(lèi)基因體計(jì)劃(Human Genome Project)預(yù)計(jì)將在2003年解出人類(lèi)所有23對(duì)染色體DNA序列，估計(jì)約有100000個(gè)基因，三億個(gè)堿基對(duì)。工程之浩大，與1969年阿波羅登月計(jì)劃同為近代人類(lèi)偉大的成就之一。因?yàn)槿祟?lèi)自350萬(wàn)年前演化至今，將第一次完整知道自己所攜帶的遺傳密碼，尤其是對(duì)于疾病的了解將有突破性的發(fā)展。除了人類(lèi)基因體計(jì)劃之外，目前已解出染色體DNA序列的生物超過(guò)了600種，包括了細(xì)菌、病毒、真核生物(果蠅、線蟲(chóng)、阿拉伯芥等)。每天都有新的DNA序列被解出，如此龐大的DNA序列對(duì)于我們而言，它猶如一本由A、T、G、C四個(gè)字母組成的天書(shū)，至于其內(nèi)部所隱含的意義，就要靠生物信息學(xué)把它譯碼成我們看得懂得“基因”，更進(jìn)一步，則需要生物芯片告訴我們基因在整個(gè)生物體內(nèi)生理、病理或藥理作用的調(diào)控，使我們對(duì)于生物有整個(gè)巨觀的認(rèn)識(shí)。

結(jié)語(yǔ)

生物芯片無(wú)疑的將在下一世紀(jì)成為最重要的生物醫(yī)學(xué)研究工具，對(duì)于我們目前所知的基因調(diào)控、新藥開(kāi)發(fā)、疾病分類(lèi)、及疾病診斷等，都將掀起重大的革命性影響。