活體動物體內(nèi)光學成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標記細胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團（GFP、RFP, Cyt及dyes等）進行標記。利用一套非常靈敏的光學檢測儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為。通過這個系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達等生物學過程。傳統(tǒng)的動物實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個時間點的實驗結(jié)果。相比之下，可見光體內(nèi)成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標（標記細胞及基因）的移動及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實可信。另外, 這一技術(shù)對腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測靈敏度極高，不涉及放射性物質(zhì)和方法, 非常安全。 因其操作極其簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點, 在剛剛發(fā)展起來的幾年時間內(nèi)，已廣泛應用于生命科學、醫(yī)學研究及藥物開發(fā)等方面。

一、 技術(shù)原理
1. 標記原理
哺乳動物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應才可以發(fā)光，因此只有在活細胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強度與標記細胞的數(shù)目線性相關。對于細菌，lux操縱子由編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成，帶有這種操縱子的細菌會持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。
基因、細胞和活體動物都可被熒光素酶基因標記。標記細胞的方法基本上是通過分子生物學克隆技術(shù), 將熒光素酶的基因插到預期觀察的細胞的染色體內(nèi)，通過單克隆細胞技術(shù)的篩選, 培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株。目前, 常用的細胞株基本上都已標記好, 市場上已有銷售。 將標記好的細胞注入小鼠體內(nèi)后, 觀測前需要注射熒光素酶的底物—熒光素，為約280道爾頓的小分子。熒光素脂溶性非常好, 很容易透過血腦屏障。注射一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標記的細胞發(fā)光30-45分鐘。每次熒光素酶催化反應只產(chǎn)生一個光子，這是肉眼無法觀察到的，應用一個高度靈敏的制冷CCD相機及特別設計的成像暗箱和成像軟件，可觀測并記錄到這些光子。

2. 光學原理
光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時會被散射和吸收，光子遇到細胞膜和細胞質(zhì)時會發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細胞和組織吸收光子的特性并不一樣。在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用靈敏的活體成像系統(tǒng)最少可以看到皮下的500個細胞，當然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的最少細胞數(shù)是不同的。在相同的深度情況下, 檢測到的發(fā)光強度和細胞的數(shù)量具有非常好的線性關系�？梢姽怏w內(nèi)成像技術(shù)的基本原理在于光可以穿透實驗動物的組織并且可由儀器量化檢測到的光強度，同時反映出細胞的數(shù)量。

3. 實驗過程
通過分子生物學克隆技術(shù), 應用單克隆細胞技術(shù)的篩選，將熒光素酶的基因穩(wěn)定整合到預期觀察的細胞的染色體內(nèi)，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶蛋白的細胞株。典型的成像過程是：小鼠經(jīng)過麻醉系統(tǒng)被麻醉后放入成像暗箱平臺，軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次背景圖。下一步，自動關閉照明燈, 在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像。 與第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。之后，軟件完成圖像分析過程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進行測量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當選定需要測量的區(qū)域后，軟件可以計算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實驗數(shù)據(jù)。軟件的數(shù)據(jù)處理和保存功能非常強大，可以加快實驗速度，方便大批量的實驗。

4．熒光成像功能
熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團到達高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白DsRed 及其它熒光報告基團，標記方法與體外熒光成像相似。熒光成像具有費用低廉和操作簡單等優(yōu)點。 同生物發(fā)光在動物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在體內(nèi)比藍綠光的穿透性要好得多，近紅外熒光為觀測生理指標的最佳選擇。
雖然熒光信號遠遠強于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠遠低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術(shù)分離背景光，但是受到熒光特性的限制，很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。目前大部分高水平的文章還是應用生物發(fā)光的方法來研究活體動物體內(nèi)成像。但是，熒光成像有其方便，便宜，直觀，標記靶點多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點，在一些植物分子生物學研究和觀察小分子體內(nèi)代謝方面也得到應用。對于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點以及實驗要求，選擇合適的方法。最近許多文獻報道的實驗中，利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對細胞或動物進行雙重標記，用成熟的熒光成像技術(shù)進行體外檢測，進行分子生物學和細胞生物學研究；然后利用生物發(fā)光技術(shù)進行動物體內(nèi)檢測， 進行活體動物體內(nèi)研究。

二、 技術(shù)應用
通過活體動物體內(nèi)成像系統(tǒng)，可以觀測到癌癥的發(fā)展進程以及中藥（單體或復方）治療所產(chǎn)生的反應，并可用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物疾病模型，觀測治療炎癥等的中藥治療效果。具體應用如下：

1.中草藥抗腫瘤療效觀察
應用活體動物體內(nèi)光學成像技術(shù)可以直接快速地測量各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并可對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測和評估。活體生物發(fā)光成像能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。生物發(fā)光成像技術(shù)提高了檢測的靈敏度，即使微小的轉(zhuǎn)移灶也能被檢測到（可以檢測到體內(nèi)102個細胞的微轉(zhuǎn)移）。
為研究目的基因是在何時、何種刺激下表達，將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實驗動物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動物模型。利用其表達產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應目的基因的表達情況，從而實現(xiàn)對目的基因的研究�？捎糜谟^察中藥誘導特定基因表達或關閉。
研究者根據(jù)研究目的，將靶基因、靶細胞、病毒及細菌進行熒光素酶標記，同時轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等等�？商峁┌谢�因在體內(nèi)的實時表達和對候選藥物的準確反應，還可以用來評估候選中藥和其它化合物的毒性。為中藥在疾病中的作用機制及效用提供研究方法。

中藥現(xiàn)代研究存在的問題：
（1）單體與復方：現(xiàn)在大家研究中藥動輒就分離單體，鑒定結(jié)構(gòu)，然后用一些需要樣品量很少的體外模型。然而通過天然藥物化學手段分離出來的成分（尤其是單體）含量極少，成本很高，往往不能滿足藥效評價的藥量，簡單的體外篩選由于藥物本身的理化性質(zhì)、體內(nèi)代謝的不同與體內(nèi)用藥差別很大，也有點偏離里中醫(yī)藥的整體思想，未能充分重視中醫(yī)藥的傳統(tǒng)經(jīng)驗。傳統(tǒng)中藥很少單用，多為組方用藥，中藥的療效主要是方劑的藥效。中藥(尤其是復方)的整體性作用機制和療效在系統(tǒng)代謝組學的研究方法下將可能得到充分的展示和“挖掘”。尋找疾病的多靶點治療方式：以"靶點"為基礎的復方研究應當加強。復方中藥運用中醫(yī)陰陽平衡理論、藏象學說和扶正祛邪等理論，合理配伍，從整體上治療許多疑難疾病。

（2）吸收現(xiàn)代科學的精華，用現(xiàn)代科學語言闡釋中醫(yī)藥理論與療效的本質(zhì)：傳統(tǒng)中藥的作用機理都是根據(jù)中醫(yī)基礎理論中的精氣神、五行等理論來解釋的，在許多方面都是很有道理的，但是中藥要現(xiàn)代化，要面向世界的話，就得在某些地方與國際醫(yī)藥衛(wèi)生的標準接軌。所以中藥現(xiàn)代化應重視中藥化學組學和中藥基因組學，將生物芯片、活體成像等為核心的技術(shù)引入到現(xiàn)代中藥研究中去。
正如前面所說，由于中藥的成分非常的復雜，各種成分的藥理和相互作用不明確，這樣很難讓外國人接受，因為他們盛行的是合成藥，是一種有效成分，或者僅僅是幾種成分，做過西藥液相或者處方篩選的戰(zhàn)友都知道西藥處方中無非就是主藥、幾種輔料混合在一起，使得主藥既能夠達到藥理作用，剛剛好在治療窗之內(nèi)，又要保證藥物的溶出（主要針對固體制劑，如片劑、膠囊等；液體制劑除外）。

（3）中藥臨床前研究：建立中藥藥動學，擁有自己的一套能夠讓人家心服口服的標準是當務之急，這對于中藥的現(xiàn)代化也許是一個里程碑。
加大給藥系統(tǒng)的研究。圍繞提高藥物的生物利用度、平穩(wěn)的血藥濃度和優(yōu)良的藥物代謝參數(shù)、給藥的靶向性三個方面去努力，最終達到以最小劑量的給藥達到治療效果，以回避可能產(chǎn)生的毒副作用。

應用舉例：喜樹堿治療腫瘤的療效觀察
Preclinical Efficacy of the Camptothecin-Polymer Conjugate IT-101inMultiple Cancer Models
Clin Cancer Res 12(5),1606-1614,March 1, 2006

Fig. 5. Antitumor effect of irinotecan at100 mg/kg (top) and IT-101at12.5 mg/kg CPTequivalents (bottom) in a disseminatedTC71-luc tumormodel (Ewing’s sarcoma) in nonobese diabetic/severe-combined immunodeficient mice.Tumor burden as a function of time (in days) was monitored using a Xenogen imaging system. Arrows, treatment n days 0, 7, and 14. Color bar, lighti ntensity emitted in photons per second.

應用活體成像技術(shù)進行中藥的療效觀察的優(yōu)勢在于：

Ø 從動物水平進行了療效觀察，避免由于體內(nèi)微環(huán)境不同而導致的療效差別。這也符合中醫(yī)整體觀念的特點，與其不某而合。
Ø 適用于中藥復方的研究，通過結(jié)果來判斷藥物的療效，給予充分的證據(jù)。
Ø 中藥藥物動力學模型的探索。
Ø 中藥配伍的優(yōu)化。通過給予不同的配伍，利用活體成像的優(yōu)勢，方便的觀察不同配伍的復方的療效差別。
Ø 中藥劑量、服藥時間、劑型的優(yōu)化

2. 中醫(yī)機理研究：標記某基因，觀察與某些中醫(yī)證侯的相關性表達，從基因水平研究中醫(yī)“證”的本質(zhì)。

藏象學說是中醫(yī)藥基礎理論的核心，辯證論治是中醫(yī)學治療疾病的核心思想。圍繞著中醫(yī)“證”本質(zhì)，近年來從現(xiàn)代科學的角度，用分子生物學的相關手段，從分子水平進行了大量的研究。中醫(yī)的“證”是辨證論治的起點和核心，辨證綜合了產(chǎn)生病變的各方面(包括當時的氣候和環(huán)境情況)因素和條件，并結(jié)合個體體質(zhì)、疾病發(fā)生的不同階段和表現(xiàn)，判定為不同的證，從而采用不同治法，通過合理配伍、適時調(diào)整藥量而達到治療效果。由此，可以認為“證”的研究能與處于科學前沿、綜合程度很強的系統(tǒng)生物學方法相結(jié)合，同時也是生命科學和臨床醫(yī)學的結(jié)合。這將把“證”的研究再次推向科學發(fā)展的前沿，成為中醫(yī)現(xiàn)代化最重要的研究方向之一。最近興起的系統(tǒng)生物學，將把系統(tǒng)論的精華、中醫(yī)學辯證論治的研究有機的結(jié)合，互相取長補短，相互滲透，充分運用中醫(yī)學整體觀念的哲學智慧，把生命科學的研究推向一個新的高度。

通過轉(zhuǎn)基因小鼠，可以方便的觀察中醫(yī)各種證侯對相關基因表達的影響，觀察藥物對于相應證侯的治療效果。如果從基因表達水平證明證的本質(zhì)，找出腎陰虛等的特異性基因，從基因水平闡釋不同體質(zhì)個體的差異，那將極大地促進中醫(yī)藥現(xiàn)代化的步伐。