基因甲基化檢測(cè)

MSP：定性；
BSP：定量；
Pyrosequencing: 焦磷酸測(cè)序法（定量）
LUMA法：定量檢測(cè)全基因組甲基化水平
MassARRAY：多位點(diǎn)、多樣本高通量定量檢測(cè)

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DNA甲基化檢測(cè)服務(wù)

甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的五號(hào)碳原子上加上甲基的共價(jià)修飾過程.

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式，它不改變DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，卻在細(xì)胞的發(fā)育、基因的表達(dá)、及基因組的穩(wěn)定性中起著重要的作用。

CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，而啟動(dòng)子CpG 島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機(jī)制。

因此，基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)在臨床診斷、藥物敏感性檢測(cè)、個(gè)性化治療等方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

一. MSP（即甲基化特異性PCR）：定性方法

該方法是檢測(cè)甲基化的經(jīng)典方法，也是最早采用的基因甲基化檢測(cè)方法。方法是：通過兩對(duì)引物，分別對(duì)應(yīng)甲基化序列和非甲基化序列，對(duì)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳分析某個(gè)基因的甲基化情況。

二. BSP（即亞硫酸鹽測(cè)序）：定量方法

該方法是通過PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，然后用甲基化分析軟件對(duì)測(cè)序序列與靶序列進(jìn)行比對(duì)分析，可以得到如下數(shù)據(jù)：

1) 測(cè)序序列與靶序列的相似度； 2）轉(zhuǎn)化效率；

3) 靶序列中每個(gè)位點(diǎn)的甲基化情況（點(diǎn)狀圖）； 4）靶序列中每個(gè)位點(diǎn)的甲基化頻率（）

三. 高通量BSP檢測(cè)

該方法將傳統(tǒng)的BSP與高通量測(cè)序（NGS）結(jié)合，既擴(kuò)展了檢測(cè)片段長(zhǎng)度，又提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)成本也較BSP有大幅度的降低。
實(shí)驗(yàn)流程如下：
1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：選擇檢測(cè)區(qū)域（Promoter/DMR）
2. 引物設(shè)計(jì)及合成：根據(jù)選定的區(qū)域設(shè)計(jì)BSP引物（可分段設(shè)計(jì)）
3. DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化：
4. PCR擴(kuò)增：用BSP引物將要檢測(cè)的片段擴(kuò)增出來（可多重PCR）
5. PCR產(chǎn)物純化：
6. PCR產(chǎn)物建庫：將純化后的PCR產(chǎn)物構(gòu)建DNA文庫
7. NGS測(cè)序：Illumina HiSeq, PE150；測(cè)序深度：>100X
8. 數(shù)據(jù)分析：?jiǎn)螛颖炯谆V，多樣本整合分析（統(tǒng)計(jì)分析），與基因表達(dá)數(shù) 據(jù)聯(lián)合分析。

四. 焦磷酸測(cè)序法(Pyrosequencing): 定量檢測(cè)單個(gè)或相鄰的幾個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化頻率

在表觀遺傳學(xué)的DNA甲基化研究中，新一代的測(cè)序方法可得到大量的全基因組甲基化特征數(shù)據(jù)，需要驗(yàn)證其中特定靶序列與表觀遺傳修飾的生理相關(guān)性。此驗(yàn)證過程較具挑戰(zhàn)性，因?yàn)榧谆稽c(diǎn)的位置和頻率的微小改變也會(huì)帶來明顯的變化。焦磷酸測(cè)序可在一次檢測(cè)中快速定量一個(gè)或多個(gè)甲基化位點(diǎn)，是理想的驗(yàn)證方法。

因此該技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中逐漸成為數(shù)據(jù)分析的金標(biāo)準(zhǔn)。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

♦ Pyrosequencing 能測(cè)定鄰近CpG區(qū)域的單個(gè)甲基化水平，甚至包括測(cè)序的引物區(qū)域

♦ 啟動(dòng)子序列中接近的不同CpG島的甲基化頻率計(jì)算

♦ 適用于新鮮冷凍，和石蠟包埋的樣本

♦ 不同的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)可同時(shí)在一次運(yùn)行中實(shí)現(xiàn)

♦ PCR反應(yīng)之后，1個(gè)小時(shí)內(nèi)可同時(shí)平行分析96個(gè)樣本

五. LUMA法：定量檢測(cè)全基因組DNA甲基化水平，而不具體于特定的基因。

原理及方法如下：

基于在DNA甲基化分析中最常用的同裂酶對(duì)HpaII/MspI， Karimiet等人建立了全基因組DNA甲基化化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)技術(shù)（Luminometric methylation assay, LUMA）.該檢測(cè)方法以EcoRI作為內(nèi)部參照。DNA將在兩個(gè)獨(dú)立酶切反應(yīng)（MspI+EcoRI和HpaII+EcoRI）中消化。EcoRI酶切后在5’端留出-AATT-，而HpaII和MspI留出了-GC-序列。然后采用焦磷酸測(cè)序平臺(tái)上的聚合酶擴(kuò)增技術(shù)填充核苷酸到5’端。最后用數(shù)學(xué)公式計(jì)算出HpaII/MspI位點(diǎn)甲基化水平即量化為全基因組甲基化的百分比。

結(jié)果計(jì)算方法如下：

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