DNA甲基化檢測(cè)服務(wù)

 甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的五號(hào)碳原子上加上甲基的共價(jià)修飾過程.

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式，它不改變DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，卻在細(xì)胞的發(fā)育、基因的表達(dá)、及基因組的穩(wěn)定性中起著重要的作用。

CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，而啟動(dòng)子CpG 島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機(jī)制。

因此，基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)在臨床診斷、藥物敏感性檢測(cè)、個(gè)性化治療等方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

該方法是檢測(cè)甲基化的經(jīng)典方法，也是最早采用的基因甲基化檢測(cè)方法。方法是：通過兩對(duì)引物，分別對(duì)應(yīng)甲基化序列和非甲基化序列，對(duì)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳分析某個(gè)基因的甲基化情況。

  二. BSP（即亞硫酸鹽測(cè)序）：定量方法

該方法是通過PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，然后用甲基化分析軟件對(duì)測(cè)序序列與靶序列進(jìn)行比對(duì)分析，可以得到如下數(shù)據(jù)：

1)  測(cè)序序列與靶序列的相似度；    2）轉(zhuǎn)化效率；

3) 靶序列中每個(gè)位點(diǎn)的甲基化情況（點(diǎn)狀圖）； 4）靶序列中每個(gè)位點(diǎn)的甲基化頻率（）

三. 高通量BSP檢測(cè)
 
    該方法將傳統(tǒng)的BSP與高通量測(cè)序（NGS）結(jié)合，既擴(kuò)展了檢測(cè)片段長(zhǎng)度，又提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)成本也較BSP有大幅度的降低。
實(shí)驗(yàn)流程如下：
1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：選擇檢測(cè)區(qū)域（Promoter/DMR）
2. 引物設(shè)計(jì)及合成：根據(jù)選定的區(qū)域設(shè)計(jì)BSP引物（可分段設(shè)計(jì)）
3. DNA亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化：
4. PCR擴(kuò)增：用BSP引物將要檢測(cè)的片段擴(kuò)增出來（可多重PCR）
5. PCR產(chǎn)物純化：
6. PCR產(chǎn)物建庫：將純化后的PCR產(chǎn)物構(gòu)建DNA文庫
7. NGS測(cè)序：Illumina HiSeq, PE150；測(cè)序深度：>100X
8. 數(shù)據(jù)分析：?jiǎn)螛颖炯谆�化譜，多樣本整合分析（統(tǒng)計(jì)分析），與基因表達(dá)數(shù) 據(jù)聯(lián)合分析。 

四. 焦磷酸測(cè)序法(Pyrosequencing):  定量檢測(cè)單個(gè)或相鄰的幾個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化頻率

    在表觀遺傳學(xué)的DNA甲基化研究中，新一代的測(cè)序方法可得到大量的全基因組甲基化特征數(shù)據(jù)，需要驗(yàn)證其中特定靶序列與表觀遺傳修飾的生理相關(guān)性。此驗(yàn)證過程較具挑戰(zhàn)性，因?yàn)榧谆�化位點(diǎn)的位置和頻率的微小改變也會(huì)帶來明顯的變化。焦磷酸測(cè)序可在一次檢測(cè)中快速定量一個(gè)或多個(gè)甲基化位點(diǎn)，是理想的驗(yàn)證方法。

       因此該技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中逐漸成為數(shù)據(jù)分析的金標(biāo)準(zhǔn)。

    技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

♦ Pyrosequencing 能測(cè)定鄰近CpG區(qū)域的單個(gè)甲基化水平，甚至包括測(cè)序的引物區(qū)域

♦ 啟動(dòng)子序列中接近的不同CpG島的甲基化頻率計(jì)算

♦ 適用于新鮮冷凍，和石蠟包埋的樣本

♦ 不同的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)可同時(shí)在一次運(yùn)行中實(shí)現(xiàn)

♦ PCR反應(yīng)之后，1個(gè)小時(shí)內(nèi)可同時(shí)平行分析96個(gè)樣本

五. LUMA法： 定量檢測(cè)全基因組DNA甲基化水平，而不具體于特定的基因。

原理及方法如下：

基于在DNA甲基化分析中最常用的同裂酶對(duì)HpaII/MspI， Karimiet等人建立了全基因組DNA甲基化化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)技術(shù)（Luminometric methylation assay, LUMA）.該檢測(cè)方法以EcoRI作為內(nèi)部參照。DNA將在兩個(gè)獨(dú)立酶切反應(yīng)（MspI+EcoRI和HpaII+EcoRI）中消化。EcoRI酶切后在5’端留出-AATT-，而HpaII和MspI留出了-GC-序列。 然后采用焦磷酸測(cè)序平臺(tái)上的聚合酶擴(kuò)增技術(shù)填充核苷酸到5’端。最后用數(shù)學(xué)公式計(jì)算出HpaII/MspI位點(diǎn)甲基化水平即量化為全基因組甲基化的百分比。

結(jié)果計(jì)算方法如下：

上海希匹吉生物技術(shù)有限公司，是致力于生物醫(yī)學(xué)相關(guān)技術(shù)服務(wù)的高科技公司。公司擁有現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)室和一流的實(shí)驗(yàn)設(shè)備（Eppendorf臺(tái)式高速冷凍離心機(jī), Heraeus、Sigma臺(tái)式離心機(jī)， Life Technologies公司Veriti梯度PCR儀、GeneAmp 9700 PCR儀、StepOne Plus熒光定量PCR儀、ViiA 7熒光定量PCR儀、微流體芯片模塊、QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)、Qubit核酸定量?jī)x，QIAGEN公司PyroMarkQ96ID焦磷酸測(cè)序平臺(tái)等）。主要參與承擔(dān)醫(yī)院、科研院所的研究項(xiàng)目及生物醫(yī)藥企業(yè)的產(chǎn)品研發(fā),服務(wù)對(duì)象覆蓋大學(xué),研究所,醫(yī)院及生物醫(yī)藥企業(yè). 服務(wù)內(nèi)容包括: 基因表達(dá)檢測(cè)(Mrna、MicroRNA) ; LncRNA檢測(cè)； SNP檢測(cè); 拷貝數(shù)變異檢測(cè)；基因甲基化檢測(cè)；焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing); 數(shù)字PCR等。

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