(1) 如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：
待標(biāo)記探針 (1.75pmol/微升) 2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1微升
T4 Polynucleotide Kinase (5-10u/微升) 1微升
總體積 10微升
按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混勻。
(2) 使用水浴或PCR儀，37℃反應(yīng)10分鐘。
(3) 加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。
(4) 再加入89微升TE，混勻。此時可以取少量探針用于檢測標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30％以上，即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡便起見，通常不必測定探針的標(biāo)記效率。
(5) 標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。
2。 . 探針的純化：
通常為實(shí)驗(yàn)簡便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如 下步驟操作：
(1) 對于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。
(2) 在-70℃至-80℃沉淀1小時，或在-20℃沉淀過夜。
(3) 在4℃，12,000g-16,000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。
(4) 在4℃，12,000g-16,000g離心1分鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。
(5) 加入100微升TE，完全溶解沉淀。標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在 -20℃。
3。EMSA 膠的配制：
(1) 準(zhǔn)備好倒膠的模具�？梢允褂贸Ｒ�(guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當(dāng)?shù)哪＞�。最好選擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具。
(2) 按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大)。
TBE buffer (10X) 1毫升
重蒸水 16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v) 2毫升
80% 甘油 625微升
10% 過硫酸銨 (ammonium persulfate) 150微升
TEMED 10微升
(3) 按照上述次序加入各個溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡， 并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。
4。EMSA結(jié)合反應(yīng)：
(1) 如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)
陰性對照反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 7微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 0微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
樣品反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 5微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
探針冷競爭反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
未標(biāo)記的探針 1微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
突變探針的冷競爭反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
未標(biāo)記的突變探針 1微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
Super-shift反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
目的蛋白特異抗體 1微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
(2) 按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25℃)放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫(20-25℃)放置20分鐘。
(3) 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻后立即上樣。注意：有些時候溴酚藍(lán)會影響蛋白和DNA的結(jié)合，建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至能觀察到藍(lán)顏色即可。
5。 電泳分析：
(1) 用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以觀察電壓是否正常進(jìn)行。
(2) 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。
(3) 按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處，停止電泳。
(4) 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。
(5) 干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測。
 

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