在現(xiàn)代生物學(xué)研究中,經(jīng)常會(huì)用到序列比較長(zhǎng)的多肽,對(duì)于序列中含有60個(gè)以上氨基酸的多肽,通常會(huì)采用基因表達(dá)及SDS-PAGE法來獲得,但是這種方法周期長(zhǎng),最終產(chǎn)物分離效果差等,使固相法長(zhǎng)肽合成技術(shù)成為一種需要。肽谷生物經(jīng)過長(zhǎng)期的摸索與積累,對(duì)合成工藝及方法不斷優(yōu)化,解決了長(zhǎng)肽合成難,純化難的問題,我們長(zhǎng)肽合成成功率高,質(zhì)量穩(wěn)定。
1. 長(zhǎng)肽合成面臨的困難及解決辦法
長(zhǎng)肽合成中,我們一直面臨一個(gè)矛盾,即合成中隨著序列的增長(zhǎng),縮合反應(yīng)空間位阻增大,為了反應(yīng)完全,需要增加反應(yīng)時(shí)間;但是隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),其產(chǎn)生的副反應(yīng)就越多, 一些缺殘基的目標(biāo)肽就隨之產(chǎn)生。這些缺殘基的肽鏈也是長(zhǎng)肽合成過程中所產(chǎn)生的主要雜質(zhì)。 因此,長(zhǎng)肽的合成過程中,我們需要克服的主要困難是探索更優(yōu)質(zhì)的反應(yīng)條件和反應(yīng)方法,從而使氨基酸縮合反應(yīng)進(jìn)行的更充分更徹底。同時(shí)縮短反應(yīng)時(shí)間,因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間越長(zhǎng),不可控的副反應(yīng)相對(duì)的就越多,副產(chǎn)物就越復(fù)雜。
為此,肽谷生物經(jīng)過多年的摸索與積累,總結(jié)出以下經(jīng)驗(yàn):
(1) 對(duì)于反應(yīng)時(shí)間實(shí)行精準(zhǔn)靈活的把控:我們?cè)诙嚯暮铣啥嗄甑慕?jīng)驗(yàn)積累,使得我們對(duì)于多肽反應(yīng)時(shí)間能夠精準(zhǔn)把控,在反應(yīng)完全-減少副產(chǎn)物上能夠找到平衡點(diǎn);
(2) 采用微波合成法:對(duì)于合成過程中出現(xiàn)的一些難以縮合的氨基酸,我們采用微波法進(jìn)行合成,該方法效果顯著,并且大大縮短了反應(yīng)時(shí)間,同時(shí)減少了兩種主要副產(chǎn)物的產(chǎn)生。
(3) 采用片段合成法:當(dāng)某些多肽用常規(guī)合成方法合成困難,并且難以純化時(shí),我們也會(huì)采用將多肽中某一段的某幾個(gè)氨基酸縮合之后作為一個(gè)整體縮合到肽鏈上去,這種方法也能夠解決許多合成中存在的問題。
(4) 采用酰肼合成法:酰肼法合成多肽的方法是固相合成的N末端Cys多肽和C末端多肽酰肼之間的化學(xué)選擇性反應(yīng)形成酰胺鍵而實(shí)現(xiàn)多肽連接的方法。該方法根據(jù)肽鏈中Cys的位置,將整條肽鏈分成多條序列分別合成,最終經(jīng)過液相合縮反應(yīng)得到目標(biāo)肽, 該方法不僅大大縮短了長(zhǎng)肽合成時(shí)間,而且顯著地提高了最終產(chǎn)物純度,因此廣泛適用于含有Cys的長(zhǎng)鏈多肽的合成。
2. 長(zhǎng)肽純化
長(zhǎng)肽的特殊性不可避免的導(dǎo)致最后得到的粗品肽組分復(fù)雜,因此,對(duì)于長(zhǎng)肽的HPLC純化也是一項(xiàng)挑戰(zhàn);我們通過在amyloid系列多肽純化過程中,吸取大量經(jīng)驗(yàn)并成功用于長(zhǎng)肽純化,我們通過采用先進(jìn)儀器,多純化體系混用,反復(fù)分離等經(jīng)驗(yàn)手段,極大提升了我們長(zhǎng)肽純化成功率。
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