一、劃痕實(shí)驗(yàn)

 

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方法，實(shí)驗(yàn)成本低，可以用來(lái)檢測(cè)貼壁生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

 

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：
 

材料：6 孔板（其他多孔板亦可，但6孔較好，大小適中）、marker筆、直尺、20微升槍頭（滅菌）、無(wú)血清培養(yǎng)基、PBS
 

步驟：所有操作器械都要提前滅菌，直尺和marker筆在操作前用紫外照射30min（超凈臺(tái)內(nèi)）

1．先用marker筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃?rùn)M線(xiàn)，大約每隔0.5~1cm一道，橫穿過(guò)孔。每孔至少穿過(guò)5條線(xiàn)。

2．在孔中加入約5X105個(gè)細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞大小及特性的不同來(lái)設(shè)定，掌握為過(guò)夜能鋪滿(mǎn)孔板為宜。

3．第二天用槍頭比著直尺進(jìn)行劃痕，直尺盡量垂直于背后的橫線(xiàn)，槍頭要垂直，不能傾斜。

4．用PBS洗3次，去除劃落的細(xì)胞，然后加入無(wú)血清培養(yǎng)基。

5．放入37度5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。之后按0，6，12，24小時(shí)取樣，拍照。

 

注意事項(xiàng)：

1. 一般做劃痕實(shí)驗(yàn)，都是在無(wú)血清或者低血清狀態(tài)下培養(yǎng)的，否則細(xì)胞本身的增殖情況就不能忽略。

 

2. 按照6孔板背后畫(huà)線(xiàn)的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點(diǎn)，作為固定的檢測(cè)點(diǎn)，這就解決了前后觀察時(shí)位置不固定的問(wèn)題。

 

 

二、Transwell檢測(cè)遷移

 

細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱(chēng)上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱(chēng)下室，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。

 

實(shí)驗(yàn)步驟：

 

1. 材料準(zhǔn)備：

可拍照顯微鏡，Transwell小室，孔徑8μm，沒(méi)包被膠的(Coster和Corning公司的也較常用)，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板24孔板。細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購(gòu)買(mǎi)的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，無(wú)血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培養(yǎng)基，DMEM完全培養(yǎng)基，1640完全培養(yǎng)基（也可加到20%血清），無(wú)菌PBS，棉簽，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，結(jié)晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS結(jié)晶紫）

 

2. 步驟和流程：

2.1基質(zhì)膠鋪板：

用BD公司的Matrigel 1：8（根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生mmp的量來(lái)決定）稀釋?zhuān)�包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。

2.2制備細(xì)胞懸液

 

①制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12－24h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。

②消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/ml。

2.3接種細(xì)胞

①取細(xì)胞懸液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%PBS的培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。

③培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。24h較常見(jiàn)，時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。

2.4結(jié)果統(tǒng)計(jì)

直接計(jì)數(shù)法，“貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)，這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過(guò)膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會(huì)掉到下室里面去，通過(guò)給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1. 取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無(wú)鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干。

2. 0 .1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3遍。

3. 400倍顯微鏡下隨即五個(gè)視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。

 

 

 

三、 Transwell檢測(cè)侵襲

 

transwell侵襲實(shí)驗(yàn)就是用一層膜將高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液和低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液隔開(kāi)，細(xì)胞放在低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液里，細(xì)胞會(huì)往高營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)液方向移動(dòng)。應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。

 

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

 

（1）共培養(yǎng)體系：

小于3.0um孔徑條件下，細(xì)胞不會(huì)遷徙通過(guò)，因此，若研究不涉及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力，不需要細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜，則應(yīng)選擇3.0µm以下孔徑。常用0.4、3.0µm。我們實(shí)驗(yàn)室用的是0.4µm。將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞A的影響。

（2）趨化性實(shí)驗(yàn)

 可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室細(xì)胞可穿過(guò)聚碳酸酯膜進(jìn)入下室，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映下室成分對(duì)上室細(xì)胞的趨化能力。
 ①細(xì)胞B對(duì)細(xì)胞A的趨化作用：將細(xì)胞A種于上室，細(xì)胞B種于下室，可以研究細(xì)胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞A的趨化作用。
 ②趨化因子對(duì)細(xì)胞的趨化作用：將細(xì)胞種于上室，下室加入某種趨化因子，可研究該趨化因子對(duì)細(xì)胞的趨化作用。

（3）腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

 常用8.0、12.0µm膜，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細(xì)胞會(huì)向營(yíng)養(yǎng)成分高的下室跑，計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反映腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

（4）腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)常用8.0、12.0µm膜，原理與腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)類(lèi)似。

 

在聚碳酸酯膜上涂上一層基質(zhì)膠，模仿細(xì)胞外基質(zhì)，上室種腫瘤細(xì)胞，下室加入FBS或?qū)嶒?yàn)設(shè)定的藥物或者影響因子，細(xì)胞會(huì)分泌相關(guān)酶類(lèi)消化模擬細(xì)胞外基質(zhì)膜的基質(zhì)膠，從而從上室遷移到下室，通過(guò)計(jì)數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量測(cè)定細(xì)胞的侵襲能力。

 

實(shí)驗(yàn)圖片示例：