簡介

       

    細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。

 

    細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。

 

 

 

漢恒為您提供如下細(xì)胞凋亡檢測服務(wù)

 

 

一、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡——Annexin V/PI 雙染色法

 

基本原理

       

    細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，目前早期識別仍有困難。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V是一種Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，最初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強(qiáng)的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用Annexin V結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗(yàn)以檢測細(xì)胞膜的完整性的檢測方法。

 

實(shí)驗(yàn)步驟

(1) 用 PBS 洗細(xì)胞培養(yǎng)板兩次，然后用胰酶消化，1000 rpm 離心 5 min，棄去培養(yǎng)液

(2) 各管加入 10 mL PBS，輕柔地懸浮細(xì)胞，洗細(xì)胞兩次

(3) 計數(shù)1x105細(xì)胞放入100ul  1X Binding Buffer，放入1.5ml EP管

(4) ANNEXIN V 5ul先孵育20min，再加入PI 3ul 再孵10min，室溫避光

(5) 加入400ul Binding Buffer,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況

 

 

 

 

二、TUNEL

 

基本原理：

 

    TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測。還可應(yīng)用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法確定細(xì)胞死亡類型和分化階段。

 

操作流程圖：

 

實(shí)驗(yàn)步驟

1）、清洗：移去完全培養(yǎng)基，用 PBS 清洗一次細(xì)胞。 

2）、固定：用 4％的多聚甲醛在室溫固定 15 分鐘。 

3）、清洗：用 PBS 在室溫漂洗三次，每次 10 分鐘。 

4）、破膜：用含 0.1%Triton-X-100 的 PBS 在室溫通透化處理 15 分鐘。 

5）、清洗：用 PBS 在室溫漂洗三次，每次 10 分鐘。 

6）、封閉：用含 5%山羊血清（BSA）的 PBS 在室溫封閉 1 小時。 

7）、清洗：TBST室溫漂洗三次，每次10分鐘。

8）、TUNEL溶液配制：Enzyme Solution和Label Solution以1：10混勻，避光備用，注意試劑用量，試劑盒價格昂貴，避免浪費(fèi)。

9）、標(biāo)記：用上訴配好的溶液，約20ul每張玻片，室溫避光孵育10分鐘，

10）、清洗：用PBS在室溫漂洗三次，每次 10 分鐘。 

11）、DAPI染核：加入 DAPI 染色液 1：2000 室溫孵育 5 分鐘。 

12）、清洗：用PBS 在室溫漂洗三次，每次 10 分鐘。 

13）、封片：用封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，免疫熒光照片用蔡司共聚焦顯微鏡。

14）、TUNEL positive dot 計算方法：DAPI和TUNEL positive dot 通過image pro軟件，計算DAPI的陽性點(diǎn)作為細(xì)胞總數(shù)，TUNEL陽性點(diǎn)作為tunel點(diǎn)，最后計算 TUNEL/DAPI×100%作為凋亡細(xì)胞的比率。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例