microRNA實(shí)時定量PCR技術(shù)服務(wù)

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)即是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實(shí)時熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物檢測定量產(chǎn)生的偏差，提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化、比較不同組織的mRNA表達(dá)差異、驗(yàn)證基因芯片和siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

康成生物mRNA實(shí)時定量PCR技術(shù)服務(wù)流程
1. 設(shè)計(jì)并合成Realtime PCR引物
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進(jìn)行含SG（SYBR® Green）的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。
3. RNA抽提
    a. 若實(shí)驗(yàn)對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。
    b. 若實(shí)驗(yàn)對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，完全吸去培養(yǎng)液后加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。
4. RNA質(zhì)量檢測
    a. 紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，以計(jì)算其濃度并評估RNA純度。
    b. 使用甲醛電泳試劑（ambion）進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。
5. cDNA合成
     按照逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen或Promega）5. 使用說明將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
6. 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(可選)
    進(jìn)行相對定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7. 實(shí)時定量PCR
     標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應(yīng)液中（其中TaqBead熱啟動聚合酶來自Promega公司），進(jìn)行RealTime PCR擴(kuò)增和檢測
8. 數(shù)據(jù)分析
    檢測結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，以對待測樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對定量實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對含量。

9. 提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告：包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)時熒光定量PCR

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