Western Blot（WB）蛋白印跡實驗在蛋白質分析中發(fā)揮著至關重要的作用，然而，對于許多新手研究人員來說，這個過程可能顯得復雜且難以理解。

為了幫助初學者快速上手并成功實施WB實驗，我們整理了從樣本制備到蛋白質檢測的每一個步驟以及相應的注意事項，另有實驗進階、疑難排查等相關內容陸續(xù)上線，敬請關注！

WB實驗原理
WB實驗的基本核心理念是抗原抗體的特異性反應，通過變性膠SDS-PAGE將不同分子量的蛋白質分離開，然后轉移到固相載體PVDF膜上，再用脫脂牛奶作為封閉液進行封閉和一抗稀釋液進行稀釋。

待靶蛋白和抗體充分結合后，用TBST洗脫液洗脫掉多余未結合的一抗，加入帶有HRP標記的對應二抗，這樣，我們的蛋白+一抗+二抗形成一個復合物，加以化學發(fā)光液，有靶蛋白的位置就會產生熒光，利用膠片或者化學發(fā)光成像儀就可以顯現靶蛋白的條帶。

WB實驗步驟及注意事項

01樣本制備
使用機械或化學方法提取生物樣本中的蛋白質， 定量總蛋白，樣品與緩沖液混合，然后在凝膠上進行電泳。

注意事項：
1. 蛋白質在樣品處理過程應在低溫下進行，以避免細胞 破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。
2. 樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出 20μL 檢測蛋白質定量用），然后 -20°或 -80℃中長期保存，注意不要反復凍融，因為會使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。
3. 切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時在處理時應注意將樣品與 loading buffer 混合均勻。

02SDS- PAGE電泳
蛋白樣品被裝載到凝膠上，通過電泳將它們按大小分開。

注意事項：
1. 配膠試劑里面的 AP 需要根據實驗室實際溫度來適量的增加或者減少，比如夏天溫度較高, 自然凝膠速度較快，AP 的量需要適當的減少；冬天溫度低，凝膠慢，需要適量的增加。
2. 灌膠時掌握好速度，避免氣泡產生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。加水液封時速度要很慢，否則膠會被沖變形。
3. 所有的蛋白樣品定量一致，體積一致，不夠的用裂解液補足，樣品兩側的泳道用等體積 的1×Loading Buffer 上樣，Marker也用1×Loading Buffer調制與樣品等體積，這樣可以避免出現誤差。
4. 電泳時間和電壓說法各異。一般電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。為減少蛋白質條帶的擴散，上樣后應盡快進行電泳，電泳結束后也應直接或者轉印。

03蛋白轉膜
將蛋白從凝膠基質移動到合成膜支持物上，并與膜相結合，形成印跡。

注意事項：
1.  選擇合適的膜和緩沖液是確保蛋白轉印成功的關鍵。必須通盤考慮蛋白質的大小和電荷、轉印方法和膜的結合特性。
2.  切濾紙和膜時一定要戴干凈手套，因為手上的蛋白會污染膜。PVDF 膜使用前用無水甲醇中浸泡 1min~2min。
3. 用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動，除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，因為一個氣泡的厚度對于蛋白來說都是十萬八千里的。
4.  用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干。這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒胡，太濕的話多余的緩沖液會導致電流短路，大大降低轉移效率。

04封閉
對轉印后的膜進行封閉，阻斷膜上未結合位點，以防止與抗體的非特異性結合。

注意事項：
做磷酸化蛋白的western時使用BSA（牛血清蛋白）作為封閉液。奶粉含有酪蛋白（一種磷酸化蛋白），如果用奶粉，有可能出現背景深的現象。并且脫脂奶粉含磷酸酶，磷酸酶與膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白時會受到影響。

05抗體孵育
膜首先與一種特異性針對目標蛋白上一個抗原表位的初級抗體孵育。經過幾次洗滌后，隨后會與一個標記的二級抗體孵育，以提供檢測的手段。

注意事項：
1. 為減少非特異結合,可選用封閉液作為一抗和二抗的抗體稀釋液。
2. 一抗孵育條件推薦 4°C過夜, 二抗孵育條件為室溫,1h。
3. 洗滌液推薦選用 TBST 緩沖液。洗滌時應保持適中的搖床速度,避免過快導致膜上的蛋白 或抗體脫落,同時確保洗滌液能夠充分接觸到膜上的每一個角落。在洗滌過程中,適時更換新的洗滌液以確保洗滌效果。
4. 洗滌過程中需要保持膜的濕潤,避免膜干燥導致抗體結合力下降或蛋白變性。

06發(fā)光顯影
將膜清洗以移除未結合的抗體后，使用二抗上的標簽來可視化感興趣的蛋白�？贵w可以標記有產生顏色和光的酶，或者直接用熒光標記來可視化蛋白。

注意事項：
1. 采用暗室膠片曝光方法，操作需要盡量熟練，除了要把握曝光時間，還要避免位移（壓片、取片過程中膠片和雜交膜不能有移動）；保留好膠片，作為原始憑證；
2. 使用化學發(fā)光成像儀采集圖像，注意采集白光下的圖像，并與發(fā)光的圖像進行融合，作為原始憑證保存。

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