Western Blot（WB）蛋白印跡實(shí)驗(yàn)在蛋白質(zhì)分析中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，然而，對(duì)于許多新手研究人員來(lái)說(shuō)，這個(gè)過(guò)程可能顯得復(fù)雜且難以理解。

為了幫助初學(xué)者快速上手并成功實(shí)施WB實(shí)驗(yàn)，我們整理了從樣本制備到蛋白質(zhì)檢測(cè)的每一個(gè)步驟以及相應(yīng)的注意事項(xiàng)，另有實(shí)驗(yàn)進(jìn)階、疑難排查等相關(guān)內(nèi)容陸續(xù)上線，敬請(qǐng)關(guān)注！

WB實(shí)驗(yàn)原理
WB實(shí)驗(yàn)的基本核心理念是抗原抗體的特異性反應(yīng)，通過(guò)變性膠SDS-PAGE將不同分子量的蛋白質(zhì)分離開，然后轉(zhuǎn)移到固相載體PVDF膜上，再用脫脂牛奶作為封閉液進(jìn)行封閉和一抗稀釋液進(jìn)行稀釋。

待靶蛋白和抗體充分結(jié)合后，用TBST洗脫液洗脫掉多余未結(jié)合的一抗，加入帶有HRP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗，這樣，我們的蛋白+一抗+二抗形成一個(gè)復(fù)合物，加以化學(xué)發(fā)光液，有靶蛋白的位置就會(huì)產(chǎn)生熒光，利用膠片或者化學(xué)發(fā)光成像儀就可以顯現(xiàn)靶蛋白的條帶。

WB實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)

01樣本制備
使用機(jī)械或化學(xué)方法提取生物樣本中的蛋白質(zhì)， 定量總蛋白，樣品與緩沖液混合，然后在凝膠上進(jìn)行電泳。

注意事項(xiàng)：
1. 蛋白質(zhì)在樣品處理過(guò)程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞 破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。
2. 樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出 20μL 檢測(cè)蛋白質(zhì)定量用），然后 -20°或 -80℃中長(zhǎng)期保存，注意不要反復(fù)凍融，因?yàn)闀?huì)使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。
3. 切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時(shí)在處理時(shí)應(yīng)注意將樣品與 loading buffer 混合均勻。

02SDS- PAGE電泳
蛋白樣品被裝載到凝膠上，通過(guò)電泳將它們按大小分開。

注意事項(xiàng)：
1. 配膠試劑里面的 AP 需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際溫度來(lái)適量的增加或者減少，比如夏天溫度較高, 自然凝膠速度較快，AP 的量需要適當(dāng)?shù)臏p少；冬天溫度低，凝膠慢，需要適量的增加。
2. 灌膠時(shí)掌握好速度，避免氣泡產(chǎn)生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。加水液封時(shí)速度要很慢，否則膠會(huì)被沖變形。
3. 所有的蛋白樣品定量一致，體積一致，不夠的用裂解液補(bǔ)足，樣品兩側(cè)的泳道用等體積 的1×Loading Buffer 上樣，Marker也用1×Loading Buffer調(diào)制與樣品等體積，這樣可以避免出現(xiàn)誤差。
4. 電泳時(shí)間和電壓說(shuō)法各異。一般電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴(kuò)散，上樣后應(yīng)盡快進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后也應(yīng)直接或者轉(zhuǎn)印。

03蛋白轉(zhuǎn)膜
將蛋白從凝膠基質(zhì)移動(dòng)到合成膜支持物上，并與膜相結(jié)合，形成印跡。

注意事項(xiàng)：
1.  選擇合適的膜和緩沖液是確保蛋白轉(zhuǎn)印成功的關(guān)鍵。必須通盤考慮蛋白質(zhì)的大小和電荷、轉(zhuǎn)印方法和膜的結(jié)合特性。
2.  切濾紙和膜時(shí)一定要戴干凈手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。PVDF 膜使用前用無(wú)水甲醇中浸泡 1min~2min。
3. 用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動(dòng)，除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去氣泡，因?yàn)橐粋�(gè)氣泡的厚度對(duì)于蛋白來(lái)說(shuō)都是十萬(wàn)八千里的。
4.  用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干。這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒胡，太濕的話多余的緩沖液會(huì)導(dǎo)致電流短路，大大降低轉(zhuǎn)移效率。

04封閉
對(duì)轉(zhuǎn)印后的膜進(jìn)行封閉，阻斷膜上未結(jié)合位點(diǎn)，以防止與抗體的非特異性結(jié)合。

注意事項(xiàng)：
做磷酸化蛋白的western時(shí)使用BSA（牛血清蛋白）作為封閉液。奶粉含有酪蛋白（一種磷酸化蛋白），如果用奶粉，有可能出現(xiàn)背景深的現(xiàn)象。并且脫脂奶粉含磷酸酶，磷酸酶與膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白時(shí)會(huì)受到影響。

05抗體孵育
膜首先與一種特異性針對(duì)目標(biāo)蛋白上一個(gè)抗原表位的初級(jí)抗體孵育。經(jīng)過(guò)幾次洗滌后，隨后會(huì)與一個(gè)標(biāo)記的二級(jí)抗體孵育，以提供檢測(cè)的手段。

注意事項(xiàng)：
1. 為減少非特異結(jié)合,可選用封閉液作為一抗和二抗的抗體稀釋液。
2. 一抗孵育條件推薦 4°C過(guò)夜, 二抗孵育條件為室溫,1h。
3. 洗滌液推薦選用 TBST 緩沖液。洗滌時(shí)應(yīng)保持適中的搖床速度,避免過(guò)快導(dǎo)致膜上的蛋白 或抗體脫落,同時(shí)確保洗滌液能夠充分接觸到膜上的每一個(gè)角落。在洗滌過(guò)程中,適時(shí)更換新的洗滌液以確保洗滌效果。
4. 洗滌過(guò)程中需要保持膜的濕潤(rùn),避免膜干燥導(dǎo)致抗體結(jié)合力下降或蛋白變性。

06發(fā)光顯影
將膜清洗以移除未結(jié)合的抗體后，使用二抗上的標(biāo)簽來(lái)可視化感興趣的蛋白。抗體可以標(biāo)記有產(chǎn)生顏色和光的酶，或者直接用熒光標(biāo)記來(lái)可視化蛋白。

注意事項(xiàng)：
1. 采用暗室膠片曝光方法，操作需要盡量熟練，除了要把握曝光時(shí)間，還要避免位移（壓片、取片過(guò)程中膠片和雜交膜不能有移動(dòng)）；保留好膠片，作為原始憑證；
2. 使用化學(xué)發(fā)光成像儀采集圖像，注意采集白光下的圖像，并與發(fā)光的圖像進(jìn)行融合，作為原始憑證保存。

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