圖 1. 抗體結(jié)構(gòu) (左) 和檢測原理 (右) 示意圖
原理:抗體是一種特異性很高的蛋白質(zhì),可以識別和結(jié)合到特定的抗原上,從而形成抗原-抗體復(fù)合物。抗體檢測利用這種特異性反應(yīng)來檢測體內(nèi)是否存在特定的抗體。
一抗二抗?傻傻分不清楚
小 M 為大家鋪墊了抗體的基礎(chǔ)知識及原理,接下來作為萌新的你可能就要問了,“抗體好像有兩個?”其實我們常說的抗體指的是第一抗體,即能和抗原特異性結(jié)合的蛋白,種類包括單克隆抗體 (monoclonal antibody,mAb) 和多克隆抗體 (polyclonal antibody, pAb)。前者可識別抗原上的單個表位,而后者能夠特異性結(jié)合同一目標抗原上的不同結(jié)合位點 (圖 2)。
圖 2. mAb 和 pAb 示意圖
表 1. mAb 和 pAb 的主要區(qū)別
二抗是能和抗體結(jié)合,即抗體的抗體,其主要作用是檢測抗體的存在,放大一抗的信號。一抗可以特異地結(jié)合目標蛋白,但通常需要發(fā)光物質(zhì)或者顯色基團標記才能被檢測出來,因此會使用可被檢測出的帶有標記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團)的二抗與一抗結(jié)合。這樣,當(dāng)一抗結(jié)合到底物上,就可以通過二抗檢測出來。
抗體選擇之一抗
01
根據(jù)所做實驗類型選擇抗體。
MCE 官網(wǎng)在產(chǎn)品頁信息 “應(yīng)用”一欄 列出了該抗體經(jīng)實驗驗證后所適用的實驗類型。
如,應(yīng)用:WB, ICC, IF, IHC-P, FC。02
分析樣本種屬
根據(jù)樣本種屬選擇抗體。
MCE 官網(wǎng)在產(chǎn)品頁信息 “反應(yīng)性”一欄列出了該抗體經(jīng)實驗驗證后所適用的種屬信息。
如,反應(yīng)性:Human, Mouse, Rat。03
選擇抗體宿主物種
一般說來,在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無偶聯(lián)物的一抗時,一抗宿主動物的物種選擇較為重要。
① 為避免抗免疫球蛋白的二抗與樣品中的內(nèi)源性免疫球蛋白間發(fā)生交叉反應(yīng),所選一抗的來源生物體應(yīng)與樣本中生物體不同。如,若研究小鼠蛋白,則應(yīng)選擇除小鼠外的生物體產(chǎn)生的一抗。假設(shè)選兔源的一抗,二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分子 (酶、熒光素、生物素等) 的抗兔 IgG。
② 如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況,除免疫組化外的其它對不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測方法,則抗體宿主物種的影響不大。
MCE 官網(wǎng)在產(chǎn)品頁信息“宿主”一欄列出了該抗體經(jīng)實驗驗證后所適用的種屬信息。
如,宿主:Rabbit。
04
分析目的蛋白的結(jié)構(gòu)區(qū)域
① 待測樣本蛋白區(qū)域:確認免疫原 (全長蛋白、蛋白質(zhì)片段、多肽、整個生物體或細胞) 與待檢測蛋白區(qū)域一致或包含在其內(nèi)。
② 樣本的提取或處理過程:有些抗體要求樣品用特定方式處理,許多抗體僅能識別已還原和變性的蛋白質(zhì)(其可暴露出蛋白質(zhì)折疊形成的二級或三級結(jié)構(gòu)中被隱藏的表位);另一方面,有些抗體僅能識別天然、折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)上的表位。抗體選擇之二抗
01
一抗的種屬來源
根據(jù)一抗的物種來源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。
① 若一抗是鼠源的單克隆抗體,二抗則選抗小鼠的二抗 (山羊抗小鼠或兔抗小鼠等)。
② 在特殊實驗中,如雙標實驗,若一抗分別為兔源和鼠來源的,則相應(yīng)的二抗應(yīng)同時為抗兔和抗鼠,可選用驢來源的二抗。02
二抗的偶聯(lián)標記
二抗的偶聯(lián)標記類型主要有:
① 酶類標記(如 AP、HRP…)③ 其他標記(如 Biotin…)
選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。
如:Western blot 和 ELISA,常用的二抗是酶標二抗;細胞或組織標記實驗 (組織免疫化學(xué),細胞免疫化學(xué),流式細胞術(shù)) 中通常使用熒光基團標記的二抗,免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。抗體選擇之內(nèi)參
選擇完抗體,還要好好思考,該怎么選擇內(nèi)參。切忌不管什么樣本,都千篇一律的選擇“GAPDH”或者“β-Actin”。此外,選擇內(nèi)參時,還需要根據(jù)內(nèi)參蛋白在樣本中相應(yīng)的表達量進行選擇。給大家整理了一份內(nèi)參選擇的攻略,請及時收好哦~表 2. 不同樣本中內(nèi)參選擇參照標準
1.你真的了解自己的蛋白嗎?
你的蛋白是否容易發(fā)生修飾?是否容易產(chǎn)生聚合體?是否存在同工異構(gòu)體?以及種屬來源都會影響蛋白的分子量。這里,小 M 給大家推薦 “UniProt” 網(wǎng)站,只有了解蛋白的“前世今生”,這世的我們才能 “雙向奔赴”,并“和平相處”呀。
2.你的樣本真的完全裂解了嗎?
這里,小 M 建議選擇合適的裂解液,如 RIPA Lysis Buffer (Strong) 并通過勻漿或超聲破碎的方式,充分使樣本裂解。
3.你真的選擇對的抗體嗎?
科研汪們,切記選擇已驗證過并高特異性的抗體哦。這里,小 M 難免想要凡爾賽一番,小 M 提供的抗體都是具備嚴格,可控的質(zhì)量標準哦。
4.你的實驗操作真的無錯可挑嗎?
這里,小 M 就實驗操作給大家淺淺的提幾條建議:注意配膠時充分混勻,關(guān)注電泳的條件。
1)選擇合適的封閉液(HY-K1027),抗體稀釋液,洗膜液(HY-K1022,HY-K1025)等。
2)配膠過程中,注意膠的狀態(tài)。實驗過程中,根據(jù)自己的目標蛋白,選擇合適的電泳條件。
目前,MCE 提供 900+ 一抗和多種二抗,涵蓋熱門靶點,助力您的科研成果 “通萬路”!快來看看咱家的明星產(chǎn)品 (因出場位置受限,只邀請了 6 位明星代表):
PI3 Kinase p55 gamma Rabbit pAb
應(yīng)用:WB, IHC-P, ICC/IF
WB analysis of PI3 Kinase p55
gamma Rabbit pAb on different
lysates.
Lane 1-3:
HEK-293T, 3T3, C6 cell lysates.
應(yīng)用:WB, ICC/IF, IP
反應(yīng)物種:Human, Mouse, Rat
WB analysis of Chk1 Rabbit
pAb on different lysates.
Lane 1-3:
THP-1, C6, PC-12 cell lysates.
應(yīng)用:WB, IP, IHC-P
反應(yīng)物種:Human, Mouse, Rat
IHC-P analysis of paraffin-
embedded human lung cancer
tissue using HDAC4 (A5)
Mouse mAb
ATP Citrate Lyase (3D9) Mouse mAb
應(yīng)用:WB, ICC/IF, FC, IHC-P
反應(yīng)物種:Human, Mouse,
Monkey
IHC-P analysis of paraffin-
embedded mouse testis tissue
using ATP Citrate Lyase (D7)
Mouse mAb.
應(yīng)用:WB, ICC/IF
反應(yīng)物種:Human, Mouse, Rat
IF analysis of JNK1 (A3)
Mouse mAb in 3T3 cells
using JNK1 antibody.
Phospho-AMPK alpha 1 (Ser496) Rabbit pAb
應(yīng)用:WB, IHC-P, ICC/IF
反應(yīng)物種:Human, Mouse, Rat
IF analysis of Phospho-AMPK
alpha 1 (Ser496) Rabbit pAb
in Hela cells using AMPK
alpha 1 (Phospho-Ser487)
antibody.
好啦,我的新朋友就介紹到這里啦!最后的最后,小 M 衷心祝福使用 MCE 抗體產(chǎn)品的科學(xué)汪都有機會得到 Science,Cell,Nature 等業(yè)內(nèi)大佬的賞識,咱們下期再會哦!
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Phospho-AKT1 (Ser473) Rabbit MAb 可檢測 AKT1 在絲氨酸 473 位點的磷酸化。AKT1 圍繞 S473 區(qū)域與 AKT2 和AKT3 中的相應(yīng)區(qū)域具有高度相似性,因此如果在相應(yīng)的絲氨酸上磷酸化,可能會與這些蛋白質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)。 |
可檢測 alpha-tubulin 總蛋白的內(nèi)源水平,并不會與重組 β-tubulin 蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。 |
可檢測 Bcl-2 總蛋白的內(nèi)源水平。 |
可識別 Caspase-11 總蛋白的內(nèi)源水平。 |
可檢測由 caspase 裂解產(chǎn)生的 PARP1 大片段 (89 kDa) 的內(nèi)源水平。該抗體不識別全長 PARP1 或其他 PARP 同工型。 |
HRP-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 在最佳條件下,將抗兔 IgG(H+L)片段與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián),在 WB 實驗中用作二抗。 |
Alexa Fluor® 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) 在最佳條件下,將抗鼠 IgG(H+L)片段與 Alexa Fluor® 488 偶聯(lián)。 |