2006年P(guān)iepenburg等研發(fā)的重組酶聚合酶擴增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA），該技術(shù)可以在37~42 ℃條件下實現(xiàn)待測靶標(biāo)的快速檢測。它具有反應(yīng)靈敏度高、特異性強、對儀器依賴程度低且可整合多種檢測模式等優(yōu)點，特別適用于基層和現(xiàn)場即時檢測。

RPA反應(yīng)由3種關(guān)鍵酶（重組酶Uvs X、單鏈結(jié)合蛋白Gp32以及鏈置換DNA聚合酶）、能量供應(yīng)體系（三磷酸腺苷、磷酸肌酸以及肌酸激酶）、穩(wěn)定反應(yīng)體系（Tris、醋酸鉀、高分子量聚乙二醇以及二硫蘇糖醇等）、三磷酸脫氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide triphosphate，dNTP）、醋酸鎂等成分組成。

RPA技術(shù)反應(yīng)原理
 
RPA反應(yīng)基本原理如下圖，主要包含5個階段：
（1）在三磷酸腺苷供能的條件下，重組酶輔因子（Uvs Y）協(xié)助Uvs X與反應(yīng)體系中的引物結(jié)合，形成酶-引物復(fù)合體，該復(fù)合體在反應(yīng)體系中尋找雙鏈DNA同源序列［3］；
（2）在同源序列處發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成D環(huán)結(jié)構(gòu)，同時Gp32與被置換的DNA單鏈結(jié)合進一步穩(wěn)定D環(huán)結(jié)構(gòu)；
（3）Uvs X從酶-引物復(fù)合體中解離，DNA聚合酶識別引物游離的3′-OH端，添加dNTPs啟動擴增反應(yīng)；
（4）模板母鏈分離，DNA子鏈合成；
（5）兩DNA子鏈合成完畢。該過程不斷循環(huán)實現(xiàn)檢測靶標(biāo)的指數(shù)擴增直到反應(yīng)體系中能量消耗殆盡。
 
影響RPA擴增的關(guān)鍵因素：引物和探針設(shè)計
目前，仍沒有一款專用的軟件可供用戶設(shè)計RPA反應(yīng)所需的引物和探針。RPA引物、探針設(shè)計對RPA反應(yīng)有重要影響，RPA引物長為30~35個堿基，不同引物、探針組合有不同的擴增效率，為達到實驗預(yù)期，進行多次篩選是必要的。探針堿基錯配將影響擴增效率，出現(xiàn)假陽性結(jié)果并總結(jié)了熒光檢測法探針的要點（熒光基團與淬滅基團之間1~2個堿基，盡可能降低G含量等）。

默瑞生物推出RPA引物/探針設(shè)計服務(wù)
基于多年來默瑞生物對Twistdx RPA相關(guān)產(chǎn)品的市場推廣工作，我們有多年豐富經(jīng)驗的技術(shù)服務(wù)團隊。應(yīng)廣大科研工作者的實際需求，最近推出以下服務(wù)項目。

客戶可根據(jù)自己需求填寫提供信息（表1），并選擇如下服務(wù)方案（表2）：

RPA檢測方法
Basic（普通電泳法）、
exo（熒光定量法）
fpg（熒光定量法）
nfo（試紙條法）
檢測靶標(biāo)信息

 

序號	物種名稱	基因名稱	基因信息（NCBI登錄號）	靶序列信息

 

方案	靶標(biāo)	引物	探針	crRNA	設(shè)計周期
1					1周
2					2周
3					3周
4					4周

方案1：甲方提供物種名稱，乙方提供該物種的診斷靶標(biāo)基因名稱、基因信息（NCBI登錄號）、靶標(biāo)基因序列信息；并出具電子版靶標(biāo)基因序列信息報告一份；
 
方案2：甲方提供物種名稱，乙方提供該物種的診斷靶標(biāo)基因名稱、基因信息（NCBI登錄號）、靶標(biāo)基因序列信息，同時乙方針對該靶點設(shè)計出三對引物供甲方篩選，并出具電子版引物信息報告（含引物特異性分析）；   
  
方案3：甲方提供物種名稱，乙方提供該物種的診斷靶標(biāo)基因名稱、基因信息（NCBI登錄號）、靶標(biāo)基因序列信息，同時乙方針對該靶點設(shè)計出三對引物和一條探針供甲方篩選，并出具電子版引物信息報告（含引物特異性分析）；
 
方案4：甲方提供物種名稱，乙方提供該物種的診斷靶標(biāo)基因名稱、基因信息（NCBI登錄號）、靶標(biāo)基因序列信息，同時乙方針對該靶點設(shè)計出三對引物、一條探針和三條相對應(yīng)的CRISPR-RNA（crRNA）供甲方篩選，并出具電子版引物信息報告（含引物特異性分析）；
 
方案5：甲方提供物種名稱，乙方提供全套的RPA或RPA-CRISPR技術(shù)服務(wù)，包括診斷靶標(biāo)的基因篩選、引物和探針的設(shè)計、特異性和靈敏度實驗驗證、實際樣品檢測及驗證等。

交貨期：自合同生效之日起3個月內(nèi)。詳情請咨詢默瑞生物。

關(guān)于默瑞生物
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產(chǎn)品包含核酸和蛋白兩大產(chǎn)品線。
(1)核酸產(chǎn)品線提供從樣品破碎儀，核酸質(zhì)控，核酸電泳，凝膠成像，到質(zhì)粒純化Kit，快速內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，PCR Mix等，給您的核酸研究工作帶來方便快捷全新的體驗。
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代理儀器產(chǎn)品有：Leica顯微系統(tǒng)，Merck Millipore實驗室純水超純水儀及配套耗材，Roche實時定量PCR儀，Partec流式細胞儀等。
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