mRNA作為一種新型的疫苗和藥物形式，為疾病的預(yù)防和治療帶來了新的希望。隨著mRNA疫苗被成功用于COVID-19的預(yù)防，國內(nèi)外針對各類傳染病、腫瘤、罕見病、自身免疫疾病等疾病的預(yù)防類疫苗或治療性藥物的研究也在如火如荼地進(jìn)行。在mRNA疫苗的研發(fā)及生產(chǎn)過程中，涉及對mRNA原料藥特性、純度、數(shù)量、物理狀態(tài)（完整性）和安全性等多方面的質(zhì)量評估，其中對mRNA完整性的評估是至關(guān)重要也是必須的步驟。

近日，中國國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心發(fā)布的《新型冠狀病毒預(yù)防用mRNA疫苗藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中指出“應(yīng)選用可充分鑒別產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)（截短mRNA、長RNA、雙鏈RNA等）且具有足夠靈敏度的檢測方法對原液、制劑等不同階段mRNA序列的完整性和純度予以確認(rèn)和控制，如毛細(xì)管電泳等。”

美國藥典（USP）關(guān)于“Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality” 的指導(dǎo)草案中也推薦使用毛細(xì)管凝膠電泳對mRNA完整性進(jìn)行質(zhì)控，其中推薦了Agilent System并詳述了其實驗方法。
   

問  USP指導(dǎo)草案中推薦的Agilent System毛細(xì)管電泳系統(tǒng)是啥？ Agilent Fragment Analyzer 自動毛細(xì)管電泳系統(tǒng)采用12/48/96多道并行毛細(xì)管電泳的原理，一次可上樣三塊96孔板，可自動連續(xù)運行288個樣品。為您提供方便的、可靠的、一致的、高通量、低成本的mRNA質(zhì)量評估。
     
問  誰在用Agilent Fragment Analyzer做mRNA疫苗質(zhì)控？
 
我們在輝瑞/BioNTech公司接受美國CBS電臺關(guān)于“How the Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine was developed”的采訪視頻中看到了Agilent（原Advanced Analytical）Fragment Analyzer的身影。
 
BioNTech的研究者于2021年發(fā)表在Nature的文章中也提到采用Agilent Fragment Analyzer毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)行mRNA完整性評估。
     
國內(nèi)眾多不便透露名字的企業(yè)和質(zhì)檢部門也在其mRNA疫苗或藥物研發(fā)及質(zhì)量評價流程中使用Agilent Fragment Analyzer毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)行mRNA完整性的評估。
 
問  Agilent Fragment Analyzer在mRNA質(zhì)量評估中的表現(xiàn)如何？
 
1  準(zhǔn)確的、高重復(fù)性的片段大小結(jié)果
采用Agilent 5200 Fragment  Analyzer對濃度分別為1ng/μL、10ng/μL、50ng/μL、100ng/μL，理論長度分別約為1,800nt 和 6,039nt 的  IVT（In vitro transcription ）mRNA進(jìn)行分析，結(jié)果顯示測得的平均片段長度分別為1,836nt和6,503 nt（見圖1和2），%CV和%Error均較低（見表1），結(jié)果表現(xiàn)出高度一致性和準(zhǔn)確性。
       

2  可檢測長達(dá)9,000nt甚至更長的mRNA
在Agilent 5200 Fragment  Analyzer上采用extended RNA method結(jié)合專門的Long RNA Ladder可實現(xiàn)對長達(dá)9,000nt甚至10,000nt的mRNA進(jìn)行準(zhǔn)確的片段大小的分析。
        
3  準(zhǔn)確表征mRNA的降解程度
Agilent Fragment  Analyzer自帶ProSize 分析軟件，用戶可通過Smear分析批量計算符合要求的RNA片段的百分比或降解的RNA的百分比。
 
對長度為9000nt的IVT mRNA進(jìn)行不同時長的70℃孵育以獲得不同程度降解的mRNA樣品，通過Agilent 5200 Fragment Analyzer system進(jìn)行檢測，結(jié)果表明Fragment Analyzer可以準(zhǔn)確表征mRNA的降解程度。
 
峰圖和凝膠圖結(jié)果顯示，隨著加孵育時間的增加，9,000nt以上的片段逐漸減少，9,000nt以下的彌散條帶逐漸增多。
 
 
通過Prosize軟件進(jìn)行計算，結(jié)果顯示75-7,500nt以下的片段百分比逐漸增多，7,500-11,000nt以上的片段百分比逐漸減少，與預(yù)期結(jié)果一致。
   
4  可用于更多的mRNA疫苗評估環(huán)節(jié)
Agilent 5200 Fragment  Analyzer還可以進(jìn)行IVT mRNA純度的檢測如是否含有未完全轉(zhuǎn)錄的DNA模板、PolyA尾長度表征等。