免疫熒光
免疫組織化學(xué)
免疫細(xì)胞化學(xué)
Western blotting
流式細(xì)胞術(shù)
原位雜交
電子顯微鏡
超級(jí)解析度顯微鏡
雙光子顯微鏡
ELISA |
Whole IgG抗體是從抗血清中分離出來的完整的分子。這些抗體有一個(gè)Fc部分和兩個(gè)與抗原結(jié)合的Fab部分,因此是二價(jià)的。Whole IgG抗體適用于多數(shù)情況,也是性價(jià)比最高的。
F(ab’)2片段抗體是用胃蛋白酶消化IgG去除Fc部分,剩下兩個(gè)靠二硫鍵連接的結(jié)合抗原的Fab部分(依然是二價(jià)的)。這些抗體用在特定的情況中,例如避免抗體與Protain A 或G結(jié)合,或者與有Fc受體的活細(xì)胞結(jié)合。
Fab片段抗體是用木瓜蛋白酶消化IgG后得到的。這些抗體只含有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。它們用來封閉內(nèi)源性的免疫球蛋白,或者在使用相同物種來源的一抗作多標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)中,用于封閉暴露的免疫球蛋白。
如何選擇Jackson二抗?
Step1:三種形式親和純化的二抗的選擇——Whole IgG 、F(ab')2 片段或Fab片段;
Step2: 確定一抗的物種來源,抗體是根據(jù)一抗的物種來源的字母表順序排列。比如,如果一抗是小鼠來源的,就找“anti-mouse”;
Step3:選擇二抗的物種來源;
Step4:選擇二抗的特異性。 注意:不同來源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu),抗體的生成過程也相似。抗一個(gè)物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng),除非事先特殊處理過-這時(shí)會(huì)標(biāo)有“(min X …Sr Prot)。下面詞語的解釋將對(duì)選擇合適的抗體有所幫助:
Anti-IgG (H+L)
這類抗體和IgG分子的重鏈和輕鏈都可以反應(yīng),比如, 和IgG分子的Fc,F(xiàn)(ab’)2/Fab部分。Anti-IgG (H+L)抗體也可以和其他的免疫球蛋白家族反應(yīng)(比如IgM和IgA),因?yàn)樗械拿庖咔虻鞍锥加邢嗤妮p鏈(κ鏈,或者λ鏈)。Anti-IgG (H+L)抗體比只抗片段的抗體識(shí)別更多的抗原表位。
Anti-IgG,F(xiàn)c fragment specific
這類抗體和IgG重鏈的Fc部分反應(yīng)。它們通過了 ELISA檢測(cè),和/或針對(duì)Fab片段吸附的測(cè)試。某些情況下,這類抗體需要額外檢測(cè)和處理來降低和IgM或IgA的交叉反應(yīng)。在這種情況下(anti- human,-mouse,-rat),它們會(huì)被描述為“Anti-IgG, Fcγfragment specific”。
Anti-IgG,F(xiàn)cγ Subclass specific
這類抗體分別和不同的小鼠IgG亞型重鏈的Fc部分反應(yīng)。它們經(jīng)過ELISA和/或針對(duì)Fab片段、IgM和其他小鼠IgG亞型的吸附測(cè)試。
Anti-IgG,F(xiàn)(ab’)2 fragment specific
這類抗體和IgG的F(ab’)2/Fab部分反應(yīng)。它們經(jīng)過了ELISA和/或Fc片段的吸附檢測(cè)。因?yàn)樗鼈兪呛洼p鏈反應(yīng),它們同時(shí)也和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白反應(yīng)(如IgM和IgA)。
(min X…Sr Prot)
這類抗體經(jīng)過了檢測(cè),以及針對(duì)IgG和圓括號(hào)中的物種的血清蛋白的吸附處理。當(dāng)其他物種免疫球蛋白的出現(xiàn)可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)時(shí),推薦使用這類抗體。但是,當(dāng)要選擇經(jīng)過針對(duì)相近物種吸附處理的抗體時(shí),要特別注意,因?yàn)樗鼈兡茏R(shí)別的表位數(shù)量大大減小了,可能識(shí)別單抗的能力很弱。
ML (Multiple Labeling)
有些抗體標(biāo)明了ML,來強(qiáng)調(diào)它們除了可以用于單標(biāo),還可用于多標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。
Step5:選擇需要的探針;
熒光團(tuán):傳統(tǒng)與新型染料可選,包括Alexa Fluor® Fluorescent Dyes 、花青染料(Cy2, Cy3, and Cy5)、DyLight 405、Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA)、luorescein Isothiocyanate (FITC) 、Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate(TRITC), Rhodamine Red-X (RRX), Texas Red (TR)等。
Table 1 Approximate peak wavelengths of excitation and emission for all fluorophore-conjugated.
熒光團(tuán)的選擇依賴于:
A.儀器。比如,光源,濾片,檢測(cè)系統(tǒng)。
B.多標(biāo)記中對(duì)色彩區(qū)分程度的要求。比如,為更好的區(qū)分Alexa Fluor® 488,選擇短發(fā)射波長(zhǎng)熒光素DyLight 405或長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)熒光素羅丹明紅-X (RRX)、Alexa Fluor® 594或Alexa Fluor® 647。
C.要求的靈敏度。比如,Alexa Fluor® 488較之FITC更亮。
Biotin-SP (長(zhǎng)連接的)
Biotin-SP是Jackson用來命名和其耦聯(lián)蛋白之間具有長(zhǎng)連接的生物素。在使用Biotin-SP耦聯(lián)的抗體作酶免疫實(shí)驗(yàn)時(shí),相比沒有長(zhǎng)連接的生物素標(biāo)記的抗體,靈敏度有很明顯的提高。
酶
Jackson提供兩種不同的酶耦聯(lián)物:辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸脂酶。
HRP耦聯(lián)物是通過Nakane和Kawaoi過程制 備的。過氧化物酶耦聯(lián)物廣泛應(yīng)用于免疫組化,Western blotting和ELISA中。堿性磷酸脂酶耦聯(lián)物是通過優(yōu)化過的Avremeas方法制備的復(fù)合物,具有高有效濃度和高分子量。它們比較靈敏,適合于 固相的免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)比如ELISA和Western blotting。
Figure 2 A Product with the code number 115-096-072 should be described as above.
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