目前，肥胖癥已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。根據(jù)世界肥胖聯(lián)盟發(fā)布的2023版《世界肥胖地圖》，到2035年，全球超重或肥胖人口將超過40億，占全球人口的51%。肥胖受環(huán)境因素影響，但也與遺傳因素密切相關(guān)。

目前最大規(guī)模的肥胖癥GWAS（Genome wide association study, 全基因組關(guān)聯(lián)分析）研究發(fā)現(xiàn)了約1000個與BMI相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（SNP），解釋了約6.0%的BMI變化。值得注意的是，多個與肥胖相關(guān)的常見變異都位于FTO基因的內(nèi)含子區(qū)域，并在大多數(shù)種族人群中顯示出肥胖的風(fēng)險效應(yīng)。其中，rs1421085 T>C變異與肥胖存在密切關(guān)聯(lián)，并被推測為功能變異之一，但在生物體水平上仍缺乏證據(jù)。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院王計秋教授領(lǐng)導(dǎo)的團隊近日利用全身性和棕色脂肪細胞特異性變異敲入方法在小鼠身上重現(xiàn)了同源的人類變異。他們發(fā)現(xiàn)，rs1421085 T>C是一種促進棕色脂肪產(chǎn)熱的功能變異。這篇題為“The rs1421085 variant within FTO promotes brown fat thermogenesis”的論文于7月17日發(fā)表在《Nature Metabolism》雜志上。
 

圖片來源：《Nature Metabolism》
（https://doi.org/10.1038/s42255-023-00847-2）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了由賽業(yè)生物構(gòu)建的兩種全身性（KI^Cas9和KI^ES）和一種棕色脂肪細胞特異性rs1421085 T>C KI小鼠模型。他們測定了各種小鼠的脂肪含量和能量消耗，并通過注射CL316,243或急性寒冷暴露來測定棕色脂肪細胞產(chǎn)熱。他們還通過RT-PCR和western blot分析來測定Ucp1等多個產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達。在分析rs1421085 T>C的作用機制時，他們采用了染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（3C-qPCR）分析。

技術(shù)路線
01 構(gòu)建KI^Cas9和KI^ES小鼠模型，測定rs1421085 T>C變異的肥胖保護作用
02 測定同源rs1421085 T>C變異是否促進棕色脂肪細胞產(chǎn)熱
03 通過棕色脂肪細胞特異性的KI小鼠模型確認rs1421085 T>C的作用確定rs1421085 T>C變異促進棕色脂肪細胞產(chǎn)熱的機制

研究結(jié)果
1.rs1421085 T>C變異增強了棕色脂肪細胞的產(chǎn)熱
分析顯示，人類rs1421085變異的T等位基因與小鼠同源位點具有高度的相似性。為了明確人類rs1421085 T>C變異的生物學(xué)功能，研究人員利用了賽業(yè)生物提供的由CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的攜帶同源單核苷酸突變的全身性基因敲入（KI）小鼠模型（KI^Cas9，圖1b）。在喂食高脂飲食后，雄性KI^Cas9小鼠的體重增加和脂肪含量少于野生型對照小鼠，特別是腹股溝白色脂肪組織（iWAT）。

為了進一步證實該變異的肥胖保護作用，他們又采用基因靶向策略，以小鼠胚胎干細胞為基礎(chǔ)構(gòu)建了第二種全身性同源rs1421085_C KI小鼠模型（KI^ES，圖1e，賽業(yè)生物提供）。與對照相比，KI^ES小鼠在高脂飲食條件下體重增加較少，脂肪量較少，且肝臟脂肪積累較少，與KI^Cas9小鼠的表型高度相似。與野生型小鼠相比，KI^ES小鼠的總能量消耗明顯增加。這些結(jié)果表明，rs1421085 T>C變異KI小鼠增加了總的能量消耗，并抵抗了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。
 

同源rs1421085 T>C變異促進了能量消耗，并抵抗了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖^[1]

研究人員注意到，KI^Cas9小鼠棕色脂肪組織（BAT）中的脂肪細胞更小更密。同時，KI^Cas9小鼠BAT中產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達也顯著增加，包括Ucp1、Pgc-1α、Prdm16等。他們隨后從BAT中分離出基質(zhì)血管成分（SVF），并在體外誘導(dǎo)為成熟的棕色脂肪細胞。與對照相比，KI^Cas9和KI^ES小鼠模型的棕色脂肪細胞的產(chǎn)熱能力增強，表現(xiàn)為產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達增加以及耗氧率增加。這些體內(nèi)和體外的結(jié)果表明，同源rs1421085 T>C變異增強了棕色脂肪細胞的產(chǎn)熱。

2.rs1421085 T>C變異抵抗了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖
為了驗證BAT中的同源rs1421085 T>C變異是否對肥胖抵抗表型有重要貢獻，研究人員將同源rs1421085^floxp/floxp（KI^fl/fl）小鼠與Ucp1-Cre小鼠雜交，構(gòu)建了棕色脂肪細胞特異性的rs1421085 T>C KI小鼠模型（圖2，賽業(yè)生物提供）。與兩個全身性KI模型相似，Ucp1-KI^fl/fl小鼠對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖也表現(xiàn)出抵抗力。值得注意的是，Ucp1-KI^fl/fl小鼠的總能量消耗與對照相比顯著增加，且脂滴變小，線粒體增加，Ucp1等產(chǎn)熱相關(guān)基因的表達也增加。綜合這三種KI模型的表型，研究人員認為同源rs1421085 T>C變異增強了棕色脂肪細胞的產(chǎn)熱，并抵抗了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。
 

棕色脂肪細胞特異性的變異敲入抵抗了高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖^[1]

3.rs1421085 T>C變異上調(diào)了FTO的表達
那么，rs1421085 T>C變異會對哪些基因的表達產(chǎn)生影響？rs1421085位點附近的幾個基因（包括IRX3/IRX5/IRX6基因簇、RPGRIP1L和FTO）被認為是FTO變異的下游候選目標。于是，研究人員評估了這些基因在三種KI小鼠模型的BAT中的表達情況，發(fā)現(xiàn)Fto在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達都顯著提高。

之前的研究發(fā)現(xiàn)，包含rs1421085的“次要等位基因”的1-kb基因組區(qū)域顯示出比主要等位基因更高的增強子活性。因此，他們構(gòu)建了攜帶1-kb人類基因組片段的報告質(zhì)粒，正向或反向插入人類FTO啟動子序列的前方。當反向連接時，攜帶T（主要）或C（次要）等位基因的片段都增強了FTO啟動子的活性，且攜帶C等位基因的片段表現(xiàn)出更高的活性（圖3）。通過染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（3C-qPCR）分析，他們發(fā)現(xiàn)KI^ES小鼠（C-等位基因攜帶者）棕色脂肪細胞與Fto啟動子的相互作用頻率高于野生型小鼠（T-等位基因攜帶者）。這一結(jié)果表明，rs1421085 T>C變異導(dǎo)致增強子區(qū)域與Fto啟動子之間形成更強的染色質(zhì)環(huán)。

同源rs1421085 T>C變異通過上調(diào)Fto表達而增加產(chǎn)熱^[1]

4.熱中性削弱了rs1421085 T>C變異的產(chǎn)熱效應(yīng)
最后，研究人員評估了小鼠中rs1421085 T>C變異對肥胖的影響是否與BAT激活程度有關(guān)，因為小鼠一直都擁有熱激活的BAT，而人類的BAT激活在出生時就達到頂峰。他們給KI^ES小鼠和野生型小鼠投喂高脂飲食，并將其置于不同溫度下。值得注意的是，22°C時觀察到的組間體重差異在30°C（熱中性）時基本消失，而30°C時KI^ES小鼠的脂肪量和脂肪組織量與野生型小鼠相當，表明當BAT失活時，熱中性可以減弱rs1421085 T>C變異對能量消耗和肥胖的影響。不過，同樣在30°C下，KI^ES小鼠注射CL316,243后的總能量消耗增加，背表面溫度升高，表明rs1421085 T>C變異促進了BAT產(chǎn)熱。

研究結(jié)論
這項研究采用三種rs1421085 T>C KI小鼠模型來探索FTO rs1421085 T>C變異的功能。在收集這些轉(zhuǎn)基因小鼠模型的體內(nèi)和體外證據(jù)后，研究人員發(fā)現(xiàn)rs1421085 T>C變異通過Fto–Ucp1軸來調(diào)控BAT產(chǎn)熱和肥胖。這一證據(jù)支持了rs1421085 T>C變異通過增強具有功能性BAT的哺乳動物的產(chǎn)熱來對抗寒冷。

原文檢索：
[1]Zhang, Z., Chen, N., Yin, N. et al. The rs1421085 variant within FTO promotes brown fat thermogenesis. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00847-2