本文來源于：細(xì)胞與基因治療領(lǐng)域

2022 年 12 月底，美國眾議院批準(zhǔn)了《FDA 現(xiàn)代化法案 2.0（FDA Modernization Act 2.0）》，F(xiàn)DA 不再對(duì)新藥和仿制藥的動(dòng)物試驗(yàn)做強(qiáng)制要求，旨在倡導(dǎo)減少動(dòng)物試驗(yàn)的使用，鼓勵(lì)在可行的情況下逐步應(yīng)用替代模型。

類器官是一種三維（3D）細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，已被證明是臨床前研究中動(dòng)物模型的絕佳替代品。在 FDA 政策的推動(dòng)下，我們可以屢屢見到國內(nèi)外類器官和器官芯片獲得融資，這一應(yīng)用方向已成為生物醫(yī)藥投融資的一大熱點(diǎn)。

近 10 年來，類器官市場(chǎng)顯著增長。2010-2020 年期間，新公司增長率高達(dá) 64%；截至 2022 年 Q4，該領(lǐng)域的累計(jì)市場(chǎng)價(jià)值約為 10.31 億美元。

2010-2022 年期間類器官市場(chǎng)的企業(yè)數(shù)量、市場(chǎng)份額

類器官是利用多能干細(xì)胞、成體干細(xì)胞等進(jìn)行體外定向誘導(dǎo)與 3D 培養(yǎng)而形成的組織器官類似物，可以模擬體內(nèi)組織的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及功能的許多方面，干細(xì)胞誘導(dǎo)生成的類器官可以用于人體組織發(fā)育、再生和修復(fù)機(jī)制方面的基礎(chǔ)研究，也可以用于診斷、疾病建模、藥物篩選評(píng)價(jià)與臨床再生醫(yī)學(xué)等【1，2】。此前，Nature Methods 評(píng)價(jià)類器官技術(shù)：利用干細(xì)胞誘導(dǎo)生成的三維組織模型，為人類生物學(xué)研究提供了強(qiáng)大的方法。迄今為止，文獻(xiàn)等資料已經(jīng)報(bào)道了許多干細(xì)胞誘導(dǎo)生成類器官培養(yǎng)方面的工程策略。

本文在總結(jié)前人資料的基礎(chǔ)上，概述了干細(xì)胞誘導(dǎo)生成類器官的培養(yǎng)方法，并簡要討論了干細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)生成類器官的關(guān)鍵因素，例如細(xì)胞的來源、細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子等。

目前，按照來源，類器官主要分為三大類：
① 多能干細(xì)胞來源類器官；
② 成體干細(xì)胞來源類器官；
③ 腫瘤組織來源的腫瘤類器官。

就類器官培養(yǎng)的初始組織細(xì)胞來源而言，盡管有報(bào)道稱，將人腎癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、肺癌和腎癌組織切碎，在液氮中保存一年多時(shí)間之后進(jìn)行復(fù)蘇及原代細(xì)胞的分離提取，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 3D 培養(yǎng)，結(jié)果表明組織凍存對(duì)于細(xì)胞活力及生長速度等無顯著影響【3】。但人們?nèi)云毡檎J(rèn)為未經(jīng)凍存的新鮮組織是類器官培養(yǎng)的最佳選擇。

類器官的制備是一項(xiàng)較為復(fù)雜的工程，類器官制備的經(jīng)典流程是將分離出來的干細(xì)胞培養(yǎng)在 3D 支架上，并向培養(yǎng)環(huán)境中添加例如表皮生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）、成纖細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等在內(nèi)的多種生長因子及其它添加物來促進(jìn)相應(yīng)類器官形成與生長，最后要對(duì)類器官進(jìn)行鑒定。

圖 1. 干細(xì)胞來源類器官培養(yǎng)流程示意圖

干細(xì)胞誘導(dǎo)生成類器官需要特定的試劑耗材等物質(zhì)條件（例如：特定的生長因子、3D 支架和干細(xì)胞分化誘導(dǎo)物等）與特定的培養(yǎng)條件（例如合適的溫度、合適的氧氣濃度、二氧化碳濃度以及一些模擬體內(nèi)情況的特定力學(xué)參數(shù)等），這些是為干細(xì)胞誘導(dǎo)生成類器官構(gòu)建一個(gè)適合其生長發(fā)育復(fù)雜微環(huán)境的極其重要條件【1】。

1、類器官多種培養(yǎng)模式
鑒于不同物理環(huán)境條件對(duì)于干細(xì)胞組織發(fā)育成類器官至關(guān)重要，目前針對(duì)干細(xì)胞誘導(dǎo)生成類器官的不同培養(yǎng)需求開發(fā)出了多種不同物理環(huán)境狀態(tài)下的培養(yǎng)模式，例如采用天然細(xì)胞外基質(zhì) 3D 支架進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)（如小腸類器官）、采用無細(xì)胞外基質(zhì)支架支撐的 3D 懸浮攪拌式培養(yǎng)（如腦類器官）、采用氣-液界面細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)（如類腎器官）等（見圖 2）。

圖 2. 不同物理環(huán)境狀態(tài)下的類器官培養(yǎng)【4】

其中，細(xì)胞外基質(zhì)為類器官細(xì)胞生長提供合適的 3D 支架，類器官細(xì)胞外基質(zhì)通過基質(zhì)膠制備，基質(zhì)膠在類器官制備成本中的占比較高，目前常用的基質(zhì)膠為美國 BD Biosciences 公司的 Matrigel®，一方面價(jià)格較高，一方面由于其來源于小鼠肉瘤細(xì)胞系，基質(zhì)膠批次間差異問題可能導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)或類器官產(chǎn)品間的質(zhì)量不一，且成分復(fù)雜、含未知的生物成分、免疫原性等問題，為基礎(chǔ)研究或臨床轉(zhuǎn)化帶來一定困難，因此，體外合成的低成本、非動(dòng)物細(xì)胞來源的細(xì)胞外基質(zhì)將是類器官行業(yè)需要解決的重要問題之一。

但靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)條件下，對(duì)供養(yǎng)和營養(yǎng)物質(zhì)的供給較為困難，尤其是大體積類型的器官【5】�？梢赃x擇性使用上述提到的攪拌式動(dòng)態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，它可以為較大體積的類器官提供充足的氧氣交換和營養(yǎng)物質(zhì)，促使類器官的發(fā)育和維持。

2、合適的生化微環(huán)境至關(guān)重要
合適的生化微環(huán)境在干細(xì)胞誘導(dǎo)生成類器官與類器官穩(wěn)態(tài)維持方面扮演重要角色，各類細(xì)胞因子或一些誘導(dǎo)物對(duì)于維持干細(xì)胞的分化、類器官的發(fā)育及穩(wěn)態(tài)所需的微環(huán)境至關(guān)重要，根據(jù)干細(xì)胞來源不同或制備的類器官種類不同，所需的添加物或細(xì)胞因子種類或組合也不同，即使結(jié)構(gòu)非常相近的組織器官，其所需的添加物或細(xì)胞因子組合也不盡相同。就細(xì)胞因子而言，經(jīng)典的細(xì)胞因子組合方案為 WENR（縮寫 WENR 為四種細(xì)胞因子 Wnt- 3a、EGF、Noggin 和 R-Spondins 分別取首字母后的組合），這四種細(xì)胞因子的增減組合適用于絕大部分的類器官培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

① Wnt 信號(hào)通路是一個(gè)非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、增殖分化、粘附及自我更新等多方面發(fā)揮重要功能，參與此信號(hào)通路的 Wnt 蛋白構(gòu)成了一個(gè)龐大的分泌蛋白家族。其中最具代表性的 Wnt3a 細(xì)胞因子，在機(jī)體內(nèi)分布廣泛，在調(diào)控細(xì)胞更新、增殖、分化與運(yùn)動(dòng)等方面至關(guān)重要，是類器官培養(yǎng)最常用的細(xì)胞因子之一。

② EGF 是目前發(fā)現(xiàn)的 EGFR 的主要配體之一。由于 EGF 配體與細(xì)胞外受體（例如 EGF）相結(jié)合，EGFR 二聚體化引起胞內(nèi)域形成酪氨酸激酶活化，激活下游信號(hào)通路，經(jīng)信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終信號(hào)傳遞至細(xì)胞核，調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)，進(jìn)而控制細(xì)胞生長分裂、分化、遷移與粘附等生理活動(dòng)。EGF 是胃腸道、甲狀腺、肝臟、腦等多種類器官培養(yǎng)所需的細(xì)胞因子。

③ R-Spondin 家族是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的 Wnt 激活劑，其家族由 4 個(gè)成員，即 R-Spondin-1 、R-Spondin-2 、R-Spondin-3 和 R-Spondin-4 組成。Wnt-R-Spondin-1 信號(hào)通路在類器官培養(yǎng)中特別重要。此信號(hào)通路的胞外 Wnt 配體需結(jié)合 Frizzled 和 Lrp5/6 而被活化，而細(xì)胞中的泛素化降解機(jī)制會(huì)降解 Frizzled，使得 Wnt 信號(hào)通路被抑制，R-spondin 可以抑制 Frizzled 的泛素化進(jìn)而促進(jìn) Wnt 通路的活化【6】，因此在類器官培養(yǎng)過程中往往 Wnt-3a 和 R-Spondin 兩種細(xì)胞因子需要同時(shí)添加。

④ Noggin 是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)的拮抗劑，在胚胎早期發(fā)育，四肢形成和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用，Noggin 作為 Wnt 信號(hào)通路及 BMP 信號(hào)的重要調(diào)控因子，在眾多組織器官發(fā)育過程中起著重要作用。

3、類器官的鑒定
由于體外干細(xì)胞誘導(dǎo)生成的類器官與其對(duì)應(yīng)的體內(nèi)組織的一致性是決定類器官質(zhì)量的關(guān)鍵，因此，要對(duì)類器官進(jìn)行鑒定。初步鑒定可使用顯微鏡和 H&E 染色方法觀察形態(tài)，評(píng)估類器官與體內(nèi)對(duì)應(yīng)組織器官是否具有相似的組織學(xué)形態(tài)特征；之后可采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WB）、qPCR、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、IHC 等檢測(cè)類器官是否表達(dá)預(yù)期的 Biomarker；類器官細(xì)胞基因情況鑒定也是必要的，通過基因測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以鑒定類器官是否有某些基因缺失突變及表達(dá)譜特征；此外，對(duì)于一些類器官，可檢測(cè)其是否具有預(yù)期功能，例如：腸類器官細(xì)胞 CFTR 活性功能檢測(cè)、心臟類器官是否可以自主跳動(dòng)等。