Nature文獻解讀：KRT13-CreER driver小鼠助力揭開氣道小丘的神秘面紗
氣道小丘是肺部組織中的神秘結構。之所以命名為小丘（hillocks），是因為基底干細胞不斷生成細胞，在組織表面形成了一個個山丘樣的結構。與典型的基底干細胞不同，這些干細胞表達鱗狀細胞標志物基因Krt13。然而，氣道小丘的具體功能仍不清楚。
麻省總醫(yī)院領導的研究團隊近日深入鑒定了氣道小丘的功能。他們發(fā)現，小丘基底干細胞能不斷補充表面上覆蓋的鱗狀屏障細胞。此外，由于小丘鱗狀細胞能夠保護下層的基底干細胞免受損傷，小丘結構對各種嚴重損傷具有廣泛的抵抗力。在氣道損傷后，這些基底干細胞能重新覆蓋氣道表面，再生出正常的氣道上皮細胞。
這篇題為“Airway hillocks are injury-resistant reservoirs of unique plastic stem cells”的論文于2024年5月1日發(fā)表在《Nature》雜志上，重塑了我們對氣道上皮再生的認識。
研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了多個小鼠模型進行譜系追蹤，其中KRT13-CreER driver小鼠由賽業(yè)生物提供。他們利用單細胞RNA測序對小丘上皮和假分層上皮進行了分析，并采用多個損傷模型來評估小丘結構對損傷的抵抗力，包括萘損傷模型。他們還開展了氣管移植培養(yǎng)，并采用共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡來觀察培養(yǎng)物。
技術路線
研究結果
小丘具有鱗狀管腔細胞
研究人員發(fā)現，小鼠小丘約占氣管管腔表面的2.5%。纖毛狀氣道上皮的經典特征是假分層，其中所有上皮細胞都與下層基底膜保持接觸。然而，小丘似乎是真正的分層結構，其特點是KRT13的表達呈梯度變化，管腔細胞表達量最高，而基底細胞表達量最低（圖1）。
掃描電鏡的圖像分析顯示，小丘符合嚴格的細胞分層標準，其管腔細胞不與基底膜接觸，是真正的鱗狀細胞（圖1）。讓人驚訝的是，小丘還是稀有細胞的荒漠，缺乏氣道上皮特有的其他稀有上皮細胞，包括離子細胞、簇細胞和神經內分泌細胞。這些結果表明，小丘是一種屏障結構，由分層且交錯的鱗狀細胞組成，它們位于基底干細胞層之上。
小丘含有不同的基底干細胞
之后，研究人員利用TRP63-CreER driver對小丘上皮的基底干細胞進行譜系標記（Trp63是基底干細胞的標志物基因）。他們發(fā)現，在三周后，整個小丘區(qū)室都被譜系標記，表明小丘管腔細胞即使在穩(wěn)態(tài)期間也會被底層的基底干細胞迅速取代。
他們之前發(fā)現，小丘管腔細胞表達了分泌細胞的標志物Scgb1a1。為了評估Scgb1a1+小丘管腔細胞是否有別于傳統(tǒng)的分泌細胞，他們開展了差異基因表達分析。結果顯示兩個細胞群的基因集完全不同。利用KRT13-CreER driver小鼠（由賽業(yè)生物提供），他們發(fā)現小丘管腔細胞在注射IL-13后沒有分化成杯狀細胞，與傳統(tǒng)的分泌細胞不同。
接下來，研究人員將重點放在小丘基底細胞上，看看它們與假分層的基底干細胞是否相同。利用與ifgMosaic報告基因小鼠交配的TRP63-CreER driver小鼠，他們對基底干細胞進行了譜系標記。三個月后，位于假分層上皮的基底干細胞產生了小克�。ê胁坏�15個細胞），而小丘內的基底干細胞產生了大克�。ǘ噙_60個細胞），表現出大規(guī)模的克隆擴增。
由此可見，小丘是一種持續(xù)存在的分層鱗狀組織結構，不包含稀有的上皮細胞類型。此外，小丘基底干細胞具有獨特的增殖能力，低水平表達與鱗狀細胞分化相關的基因。在穩(wěn)態(tài)期間，它們主要生成了快速周轉的鱗狀細胞，對周圍的假分層上皮也有少量貢獻。
小丘能抵御各種損傷
由于小丘中緊密交錯的鱗狀細胞可以作為物理屏障，研究人員接著評估了小丘抵御各種環(huán)境損傷的能力。將氣管浸泡在鹽酸內2分鐘以模擬胃酸吸入后，大部分存活細胞為小丘細胞。即使在損傷最嚴重的小丘中，管腔細胞已經凋亡，但底層的基底干細胞仍能免受損傷并存活下來（圖2）。除了抵御物理損傷，小丘對流感病毒感染也有顯著的抵抗力（圖2）。
為了確定小丘對組織修復的貢獻，他們采用了毒性氣道損傷的標準化模型，將小鼠暴露于萘（煙草煙霧毒素）中。他們利用活體成像技術直接觀察譜系標記的基底干細胞的行為，發(fā)現存活細胞的分布與小丘的分布一致，且均為KRT13+。在5天時間內，存活的細胞及其后代逐漸重新覆蓋了損傷氣管的表面。到損傷后第10天，KRT13+細胞遍布氣管上皮，并顯示出纖毛逐漸生成的跡象。
為了驗證小丘是否是纖毛上皮的來源，研究人員利用KRT13-CreER driver小鼠對小丘進行了譜系標記。結果證實，覆蓋氣管表面的細胞來源于小丘。重新覆蓋的上皮表現出可塑性，并轉化為纖毛上皮。此外，盡管小丘本身缺乏稀有上皮細胞，但來源于小丘基底干細胞的氣道上皮包含所有類型的稀有氣道上皮細胞。通過dual-ifgMosaic克隆譜系追蹤，他們發(fā)現在萘損傷后存活的基底細胞能夠大規(guī)�？寺U增，并生成所有六種類型的上皮細胞。
小丘是鱗狀上皮化生的起源之一
在比較小丘基底細胞和假分層基底細胞的轉錄組后，研究人員發(fā)現一種用于視黃酸分解的酶（Cyp26b1）在小丘基底細胞中特異性上調。在低溫損傷模型中，當視黃酸受體拮抗劑Agn193109存在時，KRT13-CreER譜系標記的氣道表面上皮比例明顯增加。基因表達分析表明視黃酸代謝在小丘基底細胞中的處理方式不同，因此他們推斷，小丘基底細胞對視黃酸信號抑制更敏感，因為它們已準備好分解視黃酸。
人類鱗狀上皮化生是在缺乏維生素A的情況下發(fā)生的，表明小丘基底干細胞對維甲酸信號抑制的功能反應可能與病理有關。研究人員使用了維生素A缺乏誘導的小鼠鱗狀上皮化生模型，發(fā)現小丘斑塊在2個月內增大了一倍多。為了確定鱗狀化生性病變是否是小丘擴增的結果，他們進行了KRT13-CreER譜系追蹤，發(fā)現鱗狀化生斑塊來源于小丘。這些結果表明，這種形式的鱗狀上皮細胞化生是小丘擴增的結果，而不是假分層上皮的化生轉化。
人類氣道中含有小丘
最后，研究人員探究了人類是否存在氣道小丘。他們在三個人類供體的肺部發(fā)現了KRT13+纖毛斑塊，這些氣管斑塊與小鼠的斑塊相似。這些纖毛斑塊包含分層的KRT13+鱗狀細胞和KRT13+基底細胞（圖3）。通過H&E染色，他們確定這些斑塊為輕度的“儲備細胞增生”，與小丘基底細胞的增殖率較高一致。在加入AGN193109后，小丘來源的培養(yǎng)物生成了纖毛狀分層結構。
圖3. 人類的氣道小丘
結論
這些結果表明，小鼠和人類小丘是獨特而稀有的干細胞庫，對各種損傷具有廣泛的抵抗力。這些干細胞能夠進行大規(guī)模克隆擴增，重新覆蓋氣道表面，形成臨時屏障上皮，然后表現出可塑性，分化成氣道上皮的所有六種細胞類型。研究還發(fā)現，小丘是“鱗狀上皮化生”的起源之一，而這被認為是鱗狀細胞癌的前兆。
原文檢索
Lin, B., Shah, V.S., Chernoff, C. et al. Airway hillocks are injury-resistant reservoirs of unique plastic stem cells. Nature 629, 869–877 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07377-1
麻省總醫(yī)院領導的研究團隊近日深入鑒定了氣道小丘的功能。他們發(fā)現，小丘基底干細胞能不斷補充表面上覆蓋的鱗狀屏障細胞。此外，由于小丘鱗狀細胞能夠保護下層的基底干細胞免受損傷，小丘結構對各種嚴重損傷具有廣泛的抵抗力。在氣道損傷后，這些基底干細胞能重新覆蓋氣道表面，再生出正常的氣道上皮細胞。
這篇題為“Airway hillocks are injury-resistant reservoirs of unique plastic stem cells”的論文于2024年5月1日發(fā)表在《Nature》雜志上，重塑了我們對氣道上皮再生的認識。
在這項研究中，研究人員使用了多個小鼠模型進行譜系追蹤，其中KRT13-CreER driver小鼠由賽業(yè)生物提供。他們利用單細胞RNA測序對小丘上皮和假分層上皮進行了分析，并采用多個損傷模型來評估小丘結構對損傷的抵抗力，包括萘損傷模型。他們還開展了氣管移植培養(yǎng)，并采用共聚焦顯微鏡和雙光子顯微鏡來觀察培養(yǎng)物。
技術路線
通過免疫染色、掃描電鏡和譜系追蹤等分析來確定小丘的分層結構
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利用多個損傷模型來評估小丘抵御各種環(huán)境損傷的能力
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利用萘損傷模型來評估小丘對組織修復的貢獻
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利用小鼠模型確定小丘擴增是維生素A缺乏誘導鱗狀上皮化生的原因
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利用多個損傷模型來評估小丘抵御各種環(huán)境損傷的能力
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利用萘損傷模型來評估小丘對組織修復的貢獻
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利用小鼠模型確定小丘擴增是維生素A缺乏誘導鱗狀上皮化生的原因
研究結果
小丘具有鱗狀管腔細胞
研究人員發(fā)現，小鼠小丘約占氣管管腔表面的2.5%。纖毛狀氣道上皮的經典特征是假分層，其中所有上皮細胞都與下層基底膜保持接觸。然而，小丘似乎是真正的分層結構，其特點是KRT13的表達呈梯度變化，管腔細胞表達量最高，而基底細胞表達量最低（圖1）。
掃描電鏡的圖像分析顯示，小丘符合嚴格的細胞分層標準，其管腔細胞不與基底膜接觸，是真正的鱗狀細胞（圖1）。讓人驚訝的是，小丘還是稀有細胞的荒漠，缺乏氣道上皮特有的其他稀有上皮細胞，包括離子細胞、簇細胞和神經內分泌細胞。這些結果表明，小丘是一種屏障結構，由分層且交錯的鱗狀細胞組成，它們位于基底干細胞層之上。
圖1. 小丘是具有鱗狀管腔細胞的分層結構
小丘含有不同的基底干細胞
之后，研究人員利用TRP63-CreER driver對小丘上皮的基底干細胞進行譜系標記（Trp63是基底干細胞的標志物基因）。他們發(fā)現，在三周后，整個小丘區(qū)室都被譜系標記，表明小丘管腔細胞即使在穩(wěn)態(tài)期間也會被底層的基底干細胞迅速取代。
他們之前發(fā)現，小丘管腔細胞表達了分泌細胞的標志物Scgb1a1。為了評估Scgb1a1+小丘管腔細胞是否有別于傳統(tǒng)的分泌細胞，他們開展了差異基因表達分析。結果顯示兩個細胞群的基因集完全不同。利用KRT13-CreER driver小鼠（由賽業(yè)生物提供），他們發(fā)現小丘管腔細胞在注射IL-13后沒有分化成杯狀細胞，與傳統(tǒng)的分泌細胞不同。
接下來，研究人員將重點放在小丘基底細胞上，看看它們與假分層的基底干細胞是否相同。利用與ifgMosaic報告基因小鼠交配的TRP63-CreER driver小鼠，他們對基底干細胞進行了譜系標記。三個月后，位于假分層上皮的基底干細胞產生了小克�。ê胁坏�15個細胞），而小丘內的基底干細胞產生了大克�。ǘ噙_60個細胞），表現出大規(guī)模的克隆擴增。
由此可見，小丘是一種持續(xù)存在的分層鱗狀組織結構，不包含稀有的上皮細胞類型。此外，小丘基底干細胞具有獨特的增殖能力，低水平表達與鱗狀細胞分化相關的基因。在穩(wěn)態(tài)期間，它們主要生成了快速周轉的鱗狀細胞，對周圍的假分層上皮也有少量貢獻。
小丘能抵御各種損傷
由于小丘中緊密交錯的鱗狀細胞可以作為物理屏障，研究人員接著評估了小丘抵御各種環(huán)境損傷的能力。將氣管浸泡在鹽酸內2分鐘以模擬胃酸吸入后，大部分存活細胞為小丘細胞。即使在損傷最嚴重的小丘中，管腔細胞已經凋亡，但底層的基底干細胞仍能免受損傷并存活下來（圖2）。除了抵御物理損傷，小丘對流感病毒感染也有顯著的抵抗力（圖2）。
圖2. 小丘能抵御各種損傷
為了確定小丘對組織修復的貢獻，他們采用了毒性氣道損傷的標準化模型，將小鼠暴露于萘（煙草煙霧毒素）中。他們利用活體成像技術直接觀察譜系標記的基底干細胞的行為，發(fā)現存活細胞的分布與小丘的分布一致，且均為KRT13+。在5天時間內，存活的細胞及其后代逐漸重新覆蓋了損傷氣管的表面。到損傷后第10天，KRT13+細胞遍布氣管上皮，并顯示出纖毛逐漸生成的跡象。
為了驗證小丘是否是纖毛上皮的來源，研究人員利用KRT13-CreER driver小鼠對小丘進行了譜系標記。結果證實，覆蓋氣管表面的細胞來源于小丘。重新覆蓋的上皮表現出可塑性，并轉化為纖毛上皮。此外，盡管小丘本身缺乏稀有上皮細胞，但來源于小丘基底干細胞的氣道上皮包含所有類型的稀有氣道上皮細胞。通過dual-ifgMosaic克隆譜系追蹤，他們發(fā)現在萘損傷后存活的基底細胞能夠大規(guī)�？寺U增，并生成所有六種類型的上皮細胞。
小丘是鱗狀上皮化生的起源之一
在比較小丘基底細胞和假分層基底細胞的轉錄組后，研究人員發(fā)現一種用于視黃酸分解的酶（Cyp26b1）在小丘基底細胞中特異性上調。在低溫損傷模型中，當視黃酸受體拮抗劑Agn193109存在時，KRT13-CreER譜系標記的氣道表面上皮比例明顯增加。基因表達分析表明視黃酸代謝在小丘基底細胞中的處理方式不同，因此他們推斷，小丘基底細胞對視黃酸信號抑制更敏感，因為它們已準備好分解視黃酸。
人類鱗狀上皮化生是在缺乏維生素A的情況下發(fā)生的，表明小丘基底干細胞對維甲酸信號抑制的功能反應可能與病理有關。研究人員使用了維生素A缺乏誘導的小鼠鱗狀上皮化生模型，發(fā)現小丘斑塊在2個月內增大了一倍多。為了確定鱗狀化生性病變是否是小丘擴增的結果，他們進行了KRT13-CreER譜系追蹤，發(fā)現鱗狀化生斑塊來源于小丘。這些結果表明，這種形式的鱗狀上皮細胞化生是小丘擴增的結果，而不是假分層上皮的化生轉化。
人類氣道中含有小丘
最后，研究人員探究了人類是否存在氣道小丘。他們在三個人類供體的肺部發(fā)現了KRT13+纖毛斑塊，這些氣管斑塊與小鼠的斑塊相似。這些纖毛斑塊包含分層的KRT13+鱗狀細胞和KRT13+基底細胞（圖3）。通過H&E染色，他們確定這些斑塊為輕度的“儲備細胞增生”，與小丘基底細胞的增殖率較高一致。在加入AGN193109后，小丘來源的培養(yǎng)物生成了纖毛狀分層結構。
圖3. 人類的氣道小丘
結論
這些結果表明，小鼠和人類小丘是獨特而稀有的干細胞庫，對各種損傷具有廣泛的抵抗力。這些干細胞能夠進行大規(guī)模克隆擴增，重新覆蓋氣道表面，形成臨時屏障上皮，然后表現出可塑性，分化成氣道上皮的所有六種細胞類型。研究還發(fā)現，小丘是“鱗狀上皮化生”的起源之一，而這被認為是鱗狀細胞癌的前兆。
原文檢索
Lin, B., Shah, V.S., Chernoff, C. et al. Airway hillocks are injury-resistant reservoirs of unique plastic stem cells. Nature 629, 869–877 (2024). https://doi.org/10.1038/s41586-024-07377-1
