小鼠模型助力研究TRIM8在肝癌中發(fā)揮致癌作用為HCC治療提供策略
肝癌是全球第六大常見惡性腫瘤，也是2020年癌癥死亡的第三大原因。肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的一種類型，占所有肝癌病例的80%至90%。盡管HCC的治療方案比以往更加多樣化，患者預(yù)后也有所改善，但早期轉(zhuǎn)移和頻繁復(fù)發(fā)導(dǎo)致晚期HCC患者的五年生存率較低。因此，迫切需要研究HCC的潛在分子機(jī)制并確定新的治療靶點(diǎn)。
三基序蛋白8（TRIM8）是一種E3連接酶，通過(guò)介導(dǎo)K63連接或K48連接的多泛素化參與底物穩(wěn)定性和功能的調(diào)節(jié)。之前的研究發(fā)現(xiàn)TRIM8在多種腫瘤類型中發(fā)揮雙重作用（致癌或抑癌），但它在HCC中的作用和潛在機(jī)制還不清楚。
上海長(zhǎng)征醫(yī)院消化內(nèi)科謝渭芬教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)近日發(fā)現(xiàn)，TRIM8通過(guò)介導(dǎo)肝細(xì)胞核因子1α（HNF1α）泛素化并促進(jìn)其蛋白降解，在HCC進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮了致癌作用。研究表明，以TRIM8-HNF1α為靶點(diǎn)也許是一種很有前景的HCC治療策略。這項(xiàng)研究成果于6月15日發(fā)表在《Cell Death & Disease》雜志上。
研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了人類HCC細(xì)胞系（包括Huh7、Hep3B和HepG2等）進(jìn)行體外分析，并使用了雄性BALB/c裸鼠進(jìn)行體內(nèi)分析。他們采用慢病毒載體來(lái)實(shí)現(xiàn)TRIM8的過(guò)表達(dá)，并使用siRNA來(lái)降低TRIM8的表達(dá)。此外，研究人員還構(gòu)建了TRIM8敲除的HepG2細(xì)胞系（由賽業(yè)生物構(gòu)建），他們發(fā)現(xiàn)TRIM8基因的敲除顯著抑制了HepG2細(xì)胞的增殖和克隆形成。并且利用免疫共沉淀和質(zhì)譜分析等，他們確認(rèn)了TRIM8與HNF1α之間的相互作用及具體機(jī)制。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
TRIM8的上調(diào)與HCC患者預(yù)后較差相關(guān)
研究人員首先搜索了癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集，以了解HCC組織中的TRIM8轉(zhuǎn)錄本水平。他們發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，TRIM8在HCC組織中的表達(dá)明顯上調(diào)（圖1）。他們還發(fā)現(xiàn)，TRIM8水平越高，HCC患者的無(wú)病生存期（DFS）和無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS）越短。與癌旁組織相比，HCC組織中TRIM8 mRNA水平升高，蛋白表達(dá)水平也明顯上調(diào)（圖1）。這些數(shù)據(jù)表明，TRIM8可作為HCC的候選診斷標(biāo)志物，其表達(dá)與HCC患者的結(jié)局存在臨床相關(guān)性。
為了確定TRIM8對(duì)人類HCC細(xì)胞系惡性特征的影響，研究人員利用慢病毒載體在MHCC-L細(xì)胞中增強(qiáng)了TRIM8的表達(dá)，并利用siRNA降低了Huh7細(xì)胞中TRIM8的表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)TRIM8能顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞在體外的增殖、集落形成、遷移和侵襲。相反，抑制它則會(huì)降低HCC細(xì)胞的惡性表型。他們還發(fā)現(xiàn)，TRIM8基因的敲除顯著抑制了HepG2細(xì)胞的增殖和克隆形成（TRIM8-KO細(xì)胞由賽業(yè)生物構(gòu)建）。因此，TRIM8在HCC中發(fā)揮了強(qiáng)大的致癌作用。
為了探索TRIM8發(fā)揮作用的潛在機(jī)制，他們利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)開展基因組富集分析。他們發(fā)現(xiàn)，DNA修復(fù)、DNA復(fù)制、G2/M檢查點(diǎn)等多條癌癥相關(guān)通路在TRIM8高表達(dá)的樣本中上調(diào)。KEGG分析也顯示，TRIM8相關(guān)基因參與了Wnt、Hippo和PPAR信號(hào)通路以及脂質(zhì)和膽固醇代謝通路。此外，RNA測(cè)序還發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞中的TRIM8基因敲除會(huì)抑制幾條癌癥相關(guān)通路，包括Wnt/β-catenin、Notch和mTORC1通路等。
TRIM8與HNF1α相互作用
為了闡明TRIM8在HCC中的分子機(jī)制，研究人員開展免疫共沉淀（Co-IP）和質(zhì)譜（MS）分析來(lái)尋找TRIM8的潛在底物。MS分析表明，肝細(xì)胞核因子1α（HNF1α）與TRIM8存在潛在的相互作用。HNF1α是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要在肝臟中表達(dá)，在肝細(xì)胞分化、代謝調(diào)控和肝功能維持中發(fā)揮作用。之前的研究發(fā)現(xiàn)，HNF1α的表達(dá)下降是HCC發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵事件。
Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TRIM8與HNF1α的相互作用，鄰位連接分析（PLA）進(jìn)一步確定了TRIM8和HNF1α在Huh7細(xì)胞中的位置相鄰（圖2）。TCGA數(shù)據(jù)表明，TRIM8的表達(dá)與HNF1α靶基因的水平呈負(fù)相關(guān)。熒光素酶報(bào)告分析表明，TRIM8能顯著抑制Huh7細(xì)胞中HNF1α的轉(zhuǎn)錄活性（圖2）。通過(guò)IPA分析，他們還發(fā)現(xiàn)HNF1α過(guò)表達(dá)細(xì)胞和TRIM8敲除細(xì)胞中上調(diào)的DEG主要與細(xì)胞周期、檢查點(diǎn)調(diào)控等通路有關(guān)，也參與了癌癥和肝臟疾病的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果表明，TRIM8與HNF1α相互作用，這種互作可能在HCC的發(fā)展過(guò)程中起了關(guān)鍵作用。
TRIM8通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑促進(jìn)HNF1α降解
通過(guò)TRIM8的過(guò)表達(dá)和敲降分析，研究人員發(fā)現(xiàn)TRIM8降低了HNF1α蛋白的表達(dá)�？紤]到TRIM8是一種E3連接酶，他們認(rèn)為TRIM8促進(jìn)了HNF1α的降解。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）處理Huh7細(xì)胞時(shí)，TRIM8能顯著縮短HNF1α的半衰期，而在過(guò)表達(dá)TRIM8后，HNF1α的降解速度明顯加快。同時(shí)，在蛋白酶體抑制劑Mg132處理后，HNF1α蛋白的水平顯著回升。他們還觀察到，TRIM8促進(jìn)了HNF1α的K48連接泛素化。由此可以看出，TRIM8通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)了HNF1α的降解。
為了確定TRIM8介導(dǎo)的HNF1α泛素化位點(diǎn)，研究人員在Huh7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TRIM8，之后分離出泛素化蛋白。他們發(fā)現(xiàn)HNF1α的第197位賴氨酸殘基被明顯泛素化。在構(gòu)建賴氨酸-精氨酸的突變體后，他們發(fā)現(xiàn)K197R突變延遲了環(huán)己酰亞胺處理后的HNF1α降解（圖3）。進(jìn)一步分析顯示，K197R突變顯著降低了HNF1α的泛素化，并抑制了TRIM8介導(dǎo)的HNF1α泛素化。這些數(shù)據(jù)表明，TRIM8在Lys197位點(diǎn)介導(dǎo)了HNF1α的泛素化。
阻斷TIRM8介導(dǎo)的HNF1α降解可抑制TRIM8的致癌作用
最后，研究人員試圖分析阻斷TRIM8對(duì)HNF1α的降解是否可抑制TRIM8在HCC中的作用。他們用表達(dá)HNF1α-WT或HNF1α-K197R的慢病毒載體感染過(guò)表達(dá)TRIM8的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)K197R突變體削弱了TRIM8對(duì)增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用。之后在裸鼠身上開展的體內(nèi)分析表明，TRIM8的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，而HNF1α-K197R逆轉(zhuǎn)了TRIM8對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。這些結(jié)果揭示了TRIM8通過(guò)介導(dǎo)HNF1α的降解在HCC中發(fā)揮致癌作用。
結(jié)論
總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究揭示了TRIM8通過(guò)對(duì)HNF1α的K48連接泛素化促進(jìn)HCC惡性進(jìn)展的新機(jī)制。它表明TRIM8-HNF1α軸既是預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的潛在指標(biāo)，也是有潛力的治療靶點(diǎn)。研究人員認(rèn)為，針對(duì)TRIM8介導(dǎo)HNF1α降解來(lái)設(shè)計(jì)方法，有望提高HCC患者的生存率。
原文檢索
Peng, Y., Qian, H., Xu, WP. et al. Tripartite motif 8 promotes the progression of hepatocellular carcinoma via mediating ubiquitination of HNF1α. Cell Death Dis 15, 416 (2024). https://doi.org/10.1038/s41419-024-06819-y
三基序蛋白8（TRIM8）是一種E3連接酶，通過(guò)介導(dǎo)K63連接或K48連接的多泛素化參與底物穩(wěn)定性和功能的調(diào)節(jié)。之前的研究發(fā)現(xiàn)TRIM8在多種腫瘤類型中發(fā)揮雙重作用（致癌或抑癌），但它在HCC中的作用和潛在機(jī)制還不清楚。
上海長(zhǎng)征醫(yī)院消化內(nèi)科謝渭芬教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)近日發(fā)現(xiàn)，TRIM8通過(guò)介導(dǎo)肝細(xì)胞核因子1α（HNF1α）泛素化并促進(jìn)其蛋白降解，在HCC進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮了致癌作用。研究表明，以TRIM8-HNF1α為靶點(diǎn)也許是一種很有前景的HCC治療策略。這項(xiàng)研究成果于6月15日發(fā)表在《Cell Death & Disease》雜志上。
研究材料與方法
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了人類HCC細(xì)胞系（包括Huh7、Hep3B和HepG2等）進(jìn)行體外分析，并使用了雄性BALB/c裸鼠進(jìn)行體內(nèi)分析。他們采用慢病毒載體來(lái)實(shí)現(xiàn)TRIM8的過(guò)表達(dá)，并使用siRNA來(lái)降低TRIM8的表達(dá)。此外，研究人員還構(gòu)建了TRIM8敲除的HepG2細(xì)胞系（由賽業(yè)生物構(gòu)建），他們發(fā)現(xiàn)TRIM8基因的敲除顯著抑制了HepG2細(xì)胞的增殖和克隆形成。并且利用免疫共沉淀和質(zhì)譜分析等，他們確認(rèn)了TRIM8與HNF1α之間的相互作用及具體機(jī)制。
技術(shù)路線
通過(guò)分析TCGA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)TRIM8表達(dá)與HCC患者結(jié)局的臨床相關(guān)性，并確定TRIM8對(duì)HCC惡性特征的影響
↓
通過(guò)Co-IP和MS等分析發(fā)現(xiàn)TRIM8與HNF1α相互作用，并與HCC進(jìn)展相關(guān)
↓
通過(guò)CHX和Mg132處理發(fā)現(xiàn)TRIM8通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)了HNF1α的降解
↓
體外和體內(nèi)分析表明HNF1α-K197R突變體可消除TRIM8的致癌作用
↓
通過(guò)Co-IP和MS等分析發(fā)現(xiàn)TRIM8與HNF1α相互作用，并與HCC進(jìn)展相關(guān)
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通過(guò)CHX和Mg132處理發(fā)現(xiàn)TRIM8通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)了HNF1α的降解
↓
體外和體內(nèi)分析表明HNF1α-K197R突變體可消除TRIM8的致癌作用
研究結(jié)果
TRIM8的上調(diào)與HCC患者預(yù)后較差相關(guān)
研究人員首先搜索了癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集，以了解HCC組織中的TRIM8轉(zhuǎn)錄本水平。他們發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，TRIM8在HCC組織中的表達(dá)明顯上調(diào)（圖1）。他們還發(fā)現(xiàn)，TRIM8水平越高，HCC患者的無(wú)病生存期（DFS）和無(wú)復(fù)發(fā)生存期（RFS）越短。與癌旁組織相比，HCC組織中TRIM8 mRNA水平升高，蛋白表達(dá)水平也明顯上調(diào)（圖1）。這些數(shù)據(jù)表明，TRIM8可作為HCC的候選診斷標(biāo)志物，其表達(dá)與HCC患者的結(jié)局存在臨床相關(guān)性。
圖1. TRIM8在HCC中的高表達(dá)與HCC患者的預(yù)后不良有關(guān)
為了確定TRIM8對(duì)人類HCC細(xì)胞系惡性特征的影響，研究人員利用慢病毒載體在MHCC-L細(xì)胞中增強(qiáng)了TRIM8的表達(dá)，并利用siRNA降低了Huh7細(xì)胞中TRIM8的表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)TRIM8能顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞在體外的增殖、集落形成、遷移和侵襲。相反，抑制它則會(huì)降低HCC細(xì)胞的惡性表型。他們還發(fā)現(xiàn)，TRIM8基因的敲除顯著抑制了HepG2細(xì)胞的增殖和克隆形成（TRIM8-KO細(xì)胞由賽業(yè)生物構(gòu)建）。因此，TRIM8在HCC中發(fā)揮了強(qiáng)大的致癌作用。
為了探索TRIM8發(fā)揮作用的潛在機(jī)制，他們利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)開展基因組富集分析。他們發(fā)現(xiàn)，DNA修復(fù)、DNA復(fù)制、G2/M檢查點(diǎn)等多條癌癥相關(guān)通路在TRIM8高表達(dá)的樣本中上調(diào)。KEGG分析也顯示，TRIM8相關(guān)基因參與了Wnt、Hippo和PPAR信號(hào)通路以及脂質(zhì)和膽固醇代謝通路。此外，RNA測(cè)序還發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞中的TRIM8基因敲除會(huì)抑制幾條癌癥相關(guān)通路，包括Wnt/β-catenin、Notch和mTORC1通路等。
TRIM8與HNF1α相互作用
為了闡明TRIM8在HCC中的分子機(jī)制，研究人員開展免疫共沉淀（Co-IP）和質(zhì)譜（MS）分析來(lái)尋找TRIM8的潛在底物。MS分析表明，肝細(xì)胞核因子1α（HNF1α）與TRIM8存在潛在的相互作用。HNF1α是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要在肝臟中表達(dá)，在肝細(xì)胞分化、代謝調(diào)控和肝功能維持中發(fā)揮作用。之前的研究發(fā)現(xiàn)，HNF1α的表達(dá)下降是HCC發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵事件。
Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TRIM8與HNF1α的相互作用，鄰位連接分析（PLA）進(jìn)一步確定了TRIM8和HNF1α在Huh7細(xì)胞中的位置相鄰（圖2）。TCGA數(shù)據(jù)表明，TRIM8的表達(dá)與HNF1α靶基因的水平呈負(fù)相關(guān)。熒光素酶報(bào)告分析表明，TRIM8能顯著抑制Huh7細(xì)胞中HNF1α的轉(zhuǎn)錄活性（圖2）。通過(guò)IPA分析，他們還發(fā)現(xiàn)HNF1α過(guò)表達(dá)細(xì)胞和TRIM8敲除細(xì)胞中上調(diào)的DEG主要與細(xì)胞周期、檢查點(diǎn)調(diào)控等通路有關(guān)，也參與了癌癥和肝臟疾病的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果表明，TRIM8與HNF1α相互作用，這種互作可能在HCC的發(fā)展過(guò)程中起了關(guān)鍵作用。
圖2. TRIM8與HNF1α相互作用并抑制HNF1α的轉(zhuǎn)錄活性
TRIM8通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑促進(jìn)HNF1α降解
通過(guò)TRIM8的過(guò)表達(dá)和敲降分析，研究人員發(fā)現(xiàn)TRIM8降低了HNF1α蛋白的表達(dá)�？紤]到TRIM8是一種E3連接酶，他們認(rèn)為TRIM8促進(jìn)了HNF1α的降解。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）處理Huh7細(xì)胞時(shí)，TRIM8能顯著縮短HNF1α的半衰期，而在過(guò)表達(dá)TRIM8后，HNF1α的降解速度明顯加快。同時(shí)，在蛋白酶體抑制劑Mg132處理后，HNF1α蛋白的水平顯著回升。他們還觀察到，TRIM8促進(jìn)了HNF1α的K48連接泛素化。由此可以看出，TRIM8通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)了HNF1α的降解。
為了確定TRIM8介導(dǎo)的HNF1α泛素化位點(diǎn)，研究人員在Huh7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TRIM8，之后分離出泛素化蛋白。他們發(fā)現(xiàn)HNF1α的第197位賴氨酸殘基被明顯泛素化。在構(gòu)建賴氨酸-精氨酸的突變體后，他們發(fā)現(xiàn)K197R突變延遲了環(huán)己酰亞胺處理后的HNF1α降解（圖3）。進(jìn)一步分析顯示，K197R突變顯著降低了HNF1α的泛素化，并抑制了TRIM8介導(dǎo)的HNF1α泛素化。這些數(shù)據(jù)表明，TRIM8在Lys197位點(diǎn)介導(dǎo)了HNF1α的泛素化。
圖3. TRIM8促進(jìn)了HNF1α的泛素化
阻斷TIRM8介導(dǎo)的HNF1α降解可抑制TRIM8的致癌作用
最后，研究人員試圖分析阻斷TRIM8對(duì)HNF1α的降解是否可抑制TRIM8在HCC中的作用。他們用表達(dá)HNF1α-WT或HNF1α-K197R的慢病毒載體感染過(guò)表達(dá)TRIM8的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)K197R突變體削弱了TRIM8對(duì)增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用。之后在裸鼠身上開展的體內(nèi)分析表明，TRIM8的過(guò)表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，而HNF1α-K197R逆轉(zhuǎn)了TRIM8對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。這些結(jié)果揭示了TRIM8通過(guò)介導(dǎo)HNF1α的降解在HCC中發(fā)揮致癌作用。
結(jié)論
總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究揭示了TRIM8通過(guò)對(duì)HNF1α的K48連接泛素化促進(jìn)HCC惡性進(jìn)展的新機(jī)制。它表明TRIM8-HNF1α軸既是預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的潛在指標(biāo)，也是有潛力的治療靶點(diǎn)。研究人員認(rèn)為，針對(duì)TRIM8介導(dǎo)HNF1α降解來(lái)設(shè)計(jì)方法，有望提高HCC患者的生存率。
原文檢索
Peng, Y., Qian, H., Xu, WP. et al. Tripartite motif 8 promotes the progression of hepatocellular carcinoma via mediating ubiquitination of HNF1α. Cell Death Dis 15, 416 (2024). https://doi.org/10.1038/s41419-024-06819-y
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