小鼠模型助力研究TRIM8在肝癌中發(fā)揮致癌作用為HCC治療提供策略
肝癌是全球第六大常見惡性腫瘤，也是2020年癌癥死亡的第三大原因。肝細胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的一種類型，占所有肝癌病例的80%至90%。盡管HCC的治療方案比以往更加多樣化，患者預后也有所改善，但早期轉移和頻繁復發(fā)導致晚期HCC患者的五年生存率較低。因此，迫切需要研究HCC的潛在分子機制并確定新的治療靶點。
三基序蛋白8（TRIM8）是一種E3連接酶，通過介導K63連接或K48連接的多泛素化參與底物穩(wěn)定性和功能的調節(jié)。之前的研究發(fā)現(xiàn)TRIM8在多種腫瘤類型中發(fā)揮雙重作用（致癌或抑癌），但它在HCC中的作用和潛在機制還不清楚。
上海長征醫(yī)院消化內科謝渭芬教授領導的研究團隊近日發(fā)現(xiàn)，TRIM8通過介導肝細胞核因子1α（HNF1α）泛素化并促進其蛋白降解，在HCC進展過程中發(fā)揮了致癌作用。研究表明，以TRIM8-HNF1α為靶點也許是一種很有前景的HCC治療策略。這項研究成果于6月15日發(fā)表在《Cell Death & Disease》雜志上。
研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了人類HCC細胞系（包括Huh7、Hep3B和HepG2等）進行體外分析，并使用了雄性BALB/c裸鼠進行體內分析。他們采用慢病毒載體來實現(xiàn)TRIM8的過表達，并使用siRNA來降低TRIM8的表達。此外，研究人員還構建了TRIM8敲除的HepG2細胞系（由賽業(yè)生物構建），他們發(fā)現(xiàn)TRIM8基因的敲除顯著抑制了HepG2細胞的增殖和克隆形成。并且利用免疫共沉淀和質譜分析等，他們確認了TRIM8與HNF1α之間的相互作用及具體機制。
技術路線
研究結果
TRIM8的上調與HCC患者預后較差相關
研究人員首先搜索了癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集，以了解HCC組織中的TRIM8轉錄本水平。他們發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，TRIM8在HCC組織中的表達明顯上調（圖1）。他們還發(fā)現(xiàn)，TRIM8水平越高，HCC患者的無病生存期（DFS）和無復發(fā)生存期（RFS）越短。與癌旁組織相比，HCC組織中TRIM8 mRNA水平升高，蛋白表達水平也明顯上調（圖1）。這些數(shù)據(jù)表明，TRIM8可作為HCC的候選診斷標志物，其表達與HCC患者的結局存在臨床相關性。
為了確定TRIM8對人類HCC細胞系惡性特征的影響，研究人員利用慢病毒載體在MHCC-L細胞中增強了TRIM8的表達，并利用siRNA降低了Huh7細胞中TRIM8的表達。他們發(fā)現(xiàn)，過表達TRIM8能顯著促進HCC細胞在體外的增殖、集落形成、遷移和侵襲。相反，抑制它則會降低HCC細胞的惡性表型。他們還發(fā)現(xiàn)，TRIM8基因的敲除顯著抑制了HepG2細胞的增殖和克隆形成（TRIM8-KO細胞由賽業(yè)生物構建）。因此，TRIM8在HCC中發(fā)揮了強大的致癌作用。
為了探索TRIM8發(fā)揮作用的潛在機制，他們利用TCGA數(shù)據(jù)庫開展基因組富集分析。他們發(fā)現(xiàn)，DNA修復、DNA復制、G2/M檢查點等多條癌癥相關通路在TRIM8高表達的樣本中上調。KEGG分析也顯示，TRIM8相關基因參與了Wnt、Hippo和PPAR信號通路以及脂質和膽固醇代謝通路。此外，RNA測序還發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞中的TRIM8基因敲除會抑制幾條癌癥相關通路，包括Wnt/β-catenin、Notch和mTORC1通路等。
TRIM8與HNF1α相互作用
為了闡明TRIM8在HCC中的分子機制，研究人員開展免疫共沉淀（Co-IP）和質譜（MS）分析來尋找TRIM8的潛在底物。MS分析表明，肝細胞核因子1α（HNF1α）與TRIM8存在潛在的相互作用。HNF1α是一種重要的轉錄因子，主要在肝臟中表達，在肝細胞分化、代謝調控和肝功能維持中發(fā)揮作用。之前的研究發(fā)現(xiàn)，HNF1α的表達下降是HCC發(fā)生和發(fā)展的關鍵事件。
Co-IP實驗證實了TRIM8與HNF1α的相互作用，鄰位連接分析（PLA）進一步確定了TRIM8和HNF1α在Huh7細胞中的位置相鄰（圖2）。TCGA數(shù)據(jù)表明，TRIM8的表達與HNF1α靶基因的水平呈負相關。熒光素酶報告分析表明，TRIM8能顯著抑制Huh7細胞中HNF1α的轉錄活性（圖2）。通過IPA分析，他們還發(fā)現(xiàn)HNF1α過表達細胞和TRIM8敲除細胞中上調的DEG主要與細胞周期、檢查點調控等通路有關，也參與了癌癥和肝臟疾病的調節(jié)。這些結果表明，TRIM8與HNF1α相互作用，這種互作可能在HCC的發(fā)展過程中起了關鍵作用。
TRIM8通過泛素-蛋白酶體途徑促進HNF1α降解
通過TRIM8的過表達和敲降分析，研究人員發(fā)現(xiàn)TRIM8降低了HNF1α蛋白的表達�？紤]到TRIM8是一種E3連接酶，他們認為TRIM8促進了HNF1α的降解。在使用蛋白質合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）處理Huh7細胞時，TRIM8能顯著縮短HNF1α的半衰期，而在過表達TRIM8后，HNF1α的降解速度明顯加快。同時，在蛋白酶體抑制劑Mg132處理后，HNF1α蛋白的水平顯著回升。他們還觀察到，TRIM8促進了HNF1α的K48連接泛素化。由此可以看出，TRIM8通過泛素-蛋白酶體途徑介導了HNF1α的降解。
為了確定TRIM8介導的HNF1α泛素化位點，研究人員在Huh7細胞中過表達TRIM8，之后分離出泛素化蛋白。他們發(fā)現(xiàn)HNF1α的第197位賴氨酸殘基被明顯泛素化。在構建賴氨酸-精氨酸的突變體后，他們發(fā)現(xiàn)K197R突變延遲了環(huán)己酰亞胺處理后的HNF1α降解（圖3）。進一步分析顯示，K197R突變顯著降低了HNF1α的泛素化，并抑制了TRIM8介導的HNF1α泛素化。這些數(shù)據(jù)表明，TRIM8在Lys197位點介導了HNF1α的泛素化。
阻斷TIRM8介導的HNF1α降解可抑制TRIM8的致癌作用
最后，研究人員試圖分析阻斷TRIM8對HNF1α的降解是否可抑制TRIM8在HCC中的作用。他們用表達HNF1α-WT或HNF1α-K197R的慢病毒載體感染過表達TRIM8的細胞，發(fā)現(xiàn)K197R突變體削弱了TRIM8對增殖、遷移和侵襲的促進作用。之后在裸鼠身上開展的體內分析表明，TRIM8的過表達促進了腫瘤的生長，而HNF1α-K197R逆轉了TRIM8對小鼠腫瘤生長的促進作用。這些結果揭示了TRIM8通過介導HNF1α的降解在HCC中發(fā)揮致癌作用。
結論
總的來說，這項研究揭示了TRIM8通過對HNF1α的K48連接泛素化促進HCC惡性進展的新機制。它表明TRIM8-HNF1α軸既是預測HCC預后的潛在指標，也是有潛力的治療靶點。研究人員認為，針對TRIM8介導HNF1α降解來設計方法，有望提高HCC患者的生存率。
原文檢索
Peng, Y., Qian, H., Xu, WP. et al. Tripartite motif 8 promotes the progression of hepatocellular carcinoma via mediating ubiquitination of HNF1α. Cell Death Dis 15, 416 (2024). https://doi.org/10.1038/s41419-024-06819-y
三基序蛋白8（TRIM8）是一種E3連接酶，通過介導K63連接或K48連接的多泛素化參與底物穩(wěn)定性和功能的調節(jié)。之前的研究發(fā)現(xiàn)TRIM8在多種腫瘤類型中發(fā)揮雙重作用（致癌或抑癌），但它在HCC中的作用和潛在機制還不清楚。
上海長征醫(yī)院消化內科謝渭芬教授領導的研究團隊近日發(fā)現(xiàn)，TRIM8通過介導肝細胞核因子1α（HNF1α）泛素化并促進其蛋白降解，在HCC進展過程中發(fā)揮了致癌作用。研究表明，以TRIM8-HNF1α為靶點也許是一種很有前景的HCC治療策略。這項研究成果于6月15日發(fā)表在《Cell Death & Disease》雜志上。
研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了人類HCC細胞系（包括Huh7、Hep3B和HepG2等）進行體外分析，并使用了雄性BALB/c裸鼠進行體內分析。他們采用慢病毒載體來實現(xiàn)TRIM8的過表達，并使用siRNA來降低TRIM8的表達。此外，研究人員還構建了TRIM8敲除的HepG2細胞系（由賽業(yè)生物構建），他們發(fā)現(xiàn)TRIM8基因的敲除顯著抑制了HepG2細胞的增殖和克隆形成。并且利用免疫共沉淀和質譜分析等，他們確認了TRIM8與HNF1α之間的相互作用及具體機制。
技術路線
通過分析TCGA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)TRIM8表達與HCC患者結局的臨床相關性，并確定TRIM8對HCC惡性特征的影響
↓
通過Co-IP和MS等分析發(fā)現(xiàn)TRIM8與HNF1α相互作用，并與HCC進展相關
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通過CHX和Mg132處理發(fā)現(xiàn)TRIM8通過泛素-蛋白酶體途徑介導了HNF1α的降解
↓
體外和體內分析表明HNF1α-K197R突變體可消除TRIM8的致癌作用
↓
通過Co-IP和MS等分析發(fā)現(xiàn)TRIM8與HNF1α相互作用，并與HCC進展相關
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通過CHX和Mg132處理發(fā)現(xiàn)TRIM8通過泛素-蛋白酶體途徑介導了HNF1α的降解
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體外和體內分析表明HNF1α-K197R突變體可消除TRIM8的致癌作用
研究結果
TRIM8的上調與HCC患者預后較差相關
研究人員首先搜索了癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集，以了解HCC組織中的TRIM8轉錄本水平。他們發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，TRIM8在HCC組織中的表達明顯上調（圖1）。他們還發(fā)現(xiàn)，TRIM8水平越高，HCC患者的無病生存期（DFS）和無復發(fā)生存期（RFS）越短。與癌旁組織相比，HCC組織中TRIM8 mRNA水平升高，蛋白表達水平也明顯上調（圖1）。這些數(shù)據(jù)表明，TRIM8可作為HCC的候選診斷標志物，其表達與HCC患者的結局存在臨床相關性。
圖1. TRIM8在HCC中的高表達與HCC患者的預后不良有關
為了確定TRIM8對人類HCC細胞系惡性特征的影響，研究人員利用慢病毒載體在MHCC-L細胞中增強了TRIM8的表達，并利用siRNA降低了Huh7細胞中TRIM8的表達。他們發(fā)現(xiàn)，過表達TRIM8能顯著促進HCC細胞在體外的增殖、集落形成、遷移和侵襲。相反，抑制它則會降低HCC細胞的惡性表型。他們還發(fā)現(xiàn)，TRIM8基因的敲除顯著抑制了HepG2細胞的增殖和克隆形成（TRIM8-KO細胞由賽業(yè)生物構建）。因此，TRIM8在HCC中發(fā)揮了強大的致癌作用。
為了探索TRIM8發(fā)揮作用的潛在機制，他們利用TCGA數(shù)據(jù)庫開展基因組富集分析。他們發(fā)現(xiàn)，DNA修復、DNA復制、G2/M檢查點等多條癌癥相關通路在TRIM8高表達的樣本中上調。KEGG分析也顯示，TRIM8相關基因參與了Wnt、Hippo和PPAR信號通路以及脂質和膽固醇代謝通路。此外，RNA測序還發(fā)現(xiàn)，HepG2細胞中的TRIM8基因敲除會抑制幾條癌癥相關通路，包括Wnt/β-catenin、Notch和mTORC1通路等。
TRIM8與HNF1α相互作用
為了闡明TRIM8在HCC中的分子機制，研究人員開展免疫共沉淀（Co-IP）和質譜（MS）分析來尋找TRIM8的潛在底物。MS分析表明，肝細胞核因子1α（HNF1α）與TRIM8存在潛在的相互作用。HNF1α是一種重要的轉錄因子，主要在肝臟中表達，在肝細胞分化、代謝調控和肝功能維持中發(fā)揮作用。之前的研究發(fā)現(xiàn)，HNF1α的表達下降是HCC發(fā)生和發(fā)展的關鍵事件。
Co-IP實驗證實了TRIM8與HNF1α的相互作用，鄰位連接分析（PLA）進一步確定了TRIM8和HNF1α在Huh7細胞中的位置相鄰（圖2）。TCGA數(shù)據(jù)表明，TRIM8的表達與HNF1α靶基因的水平呈負相關。熒光素酶報告分析表明，TRIM8能顯著抑制Huh7細胞中HNF1α的轉錄活性（圖2）。通過IPA分析，他們還發(fā)現(xiàn)HNF1α過表達細胞和TRIM8敲除細胞中上調的DEG主要與細胞周期、檢查點調控等通路有關，也參與了癌癥和肝臟疾病的調節(jié)。這些結果表明，TRIM8與HNF1α相互作用，這種互作可能在HCC的發(fā)展過程中起了關鍵作用。
圖2. TRIM8與HNF1α相互作用并抑制HNF1α的轉錄活性
TRIM8通過泛素-蛋白酶體途徑促進HNF1α降解
通過TRIM8的過表達和敲降分析，研究人員發(fā)現(xiàn)TRIM8降低了HNF1α蛋白的表達�？紤]到TRIM8是一種E3連接酶，他們認為TRIM8促進了HNF1α的降解。在使用蛋白質合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）處理Huh7細胞時，TRIM8能顯著縮短HNF1α的半衰期，而在過表達TRIM8后，HNF1α的降解速度明顯加快。同時，在蛋白酶體抑制劑Mg132處理后，HNF1α蛋白的水平顯著回升。他們還觀察到，TRIM8促進了HNF1α的K48連接泛素化。由此可以看出，TRIM8通過泛素-蛋白酶體途徑介導了HNF1α的降解。
為了確定TRIM8介導的HNF1α泛素化位點，研究人員在Huh7細胞中過表達TRIM8，之后分離出泛素化蛋白。他們發(fā)現(xiàn)HNF1α的第197位賴氨酸殘基被明顯泛素化。在構建賴氨酸-精氨酸的突變體后，他們發(fā)現(xiàn)K197R突變延遲了環(huán)己酰亞胺處理后的HNF1α降解（圖3）。進一步分析顯示，K197R突變顯著降低了HNF1α的泛素化，并抑制了TRIM8介導的HNF1α泛素化。這些數(shù)據(jù)表明，TRIM8在Lys197位點介導了HNF1α的泛素化。
圖3. TRIM8促進了HNF1α的泛素化
阻斷TIRM8介導的HNF1α降解可抑制TRIM8的致癌作用
最后，研究人員試圖分析阻斷TRIM8對HNF1α的降解是否可抑制TRIM8在HCC中的作用。他們用表達HNF1α-WT或HNF1α-K197R的慢病毒載體感染過表達TRIM8的細胞，發(fā)現(xiàn)K197R突變體削弱了TRIM8對增殖、遷移和侵襲的促進作用。之后在裸鼠身上開展的體內分析表明，TRIM8的過表達促進了腫瘤的生長，而HNF1α-K197R逆轉了TRIM8對小鼠腫瘤生長的促進作用。這些結果揭示了TRIM8通過介導HNF1α的降解在HCC中發(fā)揮致癌作用。
結論
總的來說，這項研究揭示了TRIM8通過對HNF1α的K48連接泛素化促進HCC惡性進展的新機制。它表明TRIM8-HNF1α軸既是預測HCC預后的潛在指標，也是有潛力的治療靶點。研究人員認為，針對TRIM8介導HNF1α降解來設計方法，有望提高HCC患者的生存率。
原文檢索
Peng, Y., Qian, H., Xu, WP. et al. Tripartite motif 8 promotes the progression of hepatocellular carcinoma via mediating ubiquitination of HNF1α. Cell Death Dis 15, 416 (2024). https://doi.org/10.1038/s41419-024-06819-y
