初次操作Western Blot，制膠是非常關(guān)鍵的一步。如何快速、高效地完成制膠，并確保實驗成功？以下是幾個新手必知的小技巧，讓你輕松搞定WB制膠。

實驗前的準(zhǔn)備：
1. 玻璃板和梳子的清潔
用自來水浸泡5分鐘，洗潔精清洗，特別注意溝槽的清潔。清洗后用純水沖洗，37度烘干或吹干。

2. 制膠試劑的準(zhǔn)備
包括超純水、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8 Tris-HCl、10% SDS、10% APS、TEMED，以及95%酒精。注意試劑的有效期和儲存條件，如丙烯酰胺需避光4度保存，APS需-20度冷凍。

凝膠的制備：

1. 精準(zhǔn)配比，避免誤差
嚴(yán)格按照實驗要求配制分離膠和濃縮膠，確保濃度準(zhǔn)確，特別是丙烯酰胺的比例，一旦偏差會影響蛋白質(zhì)的分離效果。

2. 確保溶液新鮮
TEMED和APS是制膠的關(guān)鍵成分，注意它們的保存期限，使用前最好現(xiàn)配，保證它們的新鮮度來確保膠的聚合效果。

3.操作快速，高效制膠
制膠時，特別是加入TEMED和APS后，需要迅速操作，因為這兩者會加速凝膠的聚合反應(yīng)，延遲可能導(dǎo)致膠體不均勻。分離膠灌膠后用酒精壓平。

4.濃縮膠及插梳子
確認(rèn)分離膠凝固后，倒掉酒精，吸干后迅速灌入濃縮膠并插入梳子。

5.除去氣泡
澆膠過程中，小心氣泡的產(chǎn)生，尤其在加入樣品孔梳時。如果有氣泡，可以用移液器輕輕吸走，保證膠體表面平整。

6.調(diào)控pH值，影響分辨率
不同分子量的蛋白質(zhì)需要不同pH值的緩沖液，確保正確的pH值有助于提高蛋白質(zhì)的分辨率。

7.凝膠的暫存
凝膠凝固后，取下玻璃板，用保鮮膜包裹，4度冰箱保存，不超過一周。

8.熟練掌握
Western Blot制膠雖然看似復(fù)雜，但熟能生巧，多練幾次你就能找到最適合自己操作的節(jié)奏！

常見問題及解決方法：

1. 漏膠
通常是玻璃板未對齊或底部缺損導(dǎo)致。確保玻璃板干燥并對齊。

2. 膠不凝
多為APS失效。確保APS新鮮，并妥善保存。

3.膠凝固不均勻
可能是玻璃板未洗凈或試劑混合不均。確保玻璃板和試劑清潔。

4.膠中有氣泡
分離膠氣泡可能是膠墊問題，濃縮膠氣泡可能是梳子插入不當(dāng)。使用實心膠墊或正確插入梳子。

5.濃縮膠邊緣有缺損
可能是厚玻璃板邊條密閉性不良。檢查并更換必要的配件。

6.拔梳子后泳道有膠絲
減少TEMED的量，避免膠過早凝固。

7.泳道歪了
梳子與玻璃板不匹配。確保梳子與玻璃板規(guī)格相符。

8.電泳出現(xiàn)“漏樣"
避免玻璃板與膠分離。小心操作，避免強行分離玻璃板。

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