眾所周知，WB實(shí)驗(yàn)是蛋白質(zhì)研究的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)之一。WB的操作看似簡單，做好確是不簡單的。要想取得漂亮的WB條帶，樣品的制備是前提保證。樣本制備是WB實(shí)驗(yàn)的第一步也是最重要的一步，可分為樣本采集、樣本裂解、蛋白定量和蛋白變性四個(gè)步驟。在此過程中，大家會(huì)遇到各種奇奇怪怪的問題，這里給大家匯總了一些樣本制備過程中經(jīng)常遇到的問題及解決方案，為大家答疑解惑。

問題一：出現(xiàn)透明膠狀物  

可能原因：基因組復(fù)合物釋放出來

解決方案：

1.適當(dāng)超聲或使用1ml注射器反復(fù)抽吸可以打斷基因組DNA從而使粘稠感消失。

2.加入loading buffer煮沸變性的時(shí)候，可以稍微延長煮沸的時(shí)間，充分煮沸后一方面可以使結(jié)合在基因組DNA上的蛋白充分釋放，同時(shí)可導(dǎo)致基因組DNA的部分?jǐn)嗔褟亩�使粘稠感消失�?/p>

3.裂解的時(shí)候在裂解液中加入廣譜核酸酶。

 問題二：蛋白濃度低  

可能原因：

1.細(xì)胞或者組織量偏少。

2.樣本跟裂解液的比例不合適。

3.沒有充分裂解，或者裂解過程中蛋白降解。

解決方案：

1.增加樣本量。

2.根據(jù)樣本的量調(diào)整裂解液量。

3.裂解時(shí)間要充足，組織樣本要借助物理破碎，細(xì)胞樣本要吹打或者顛倒混勻，裂解液里要加酶抑制劑。

 問題三：上清漂浮一層油脂  

可能原因：樣本富含脂肪

解決方案：

1.裂解后樣本低溫靜置，吸出漂浮的油脂。

2.當(dāng)吸取依然達(dá)不到要求的時(shí)候,可以嘗試用二氧化硅吸附。

 問題四：貼壁細(xì)胞收集是刮下來還是胰酶消化  

解決方案：

兩種方式都是可行的，各有利弊。不必?fù)?dān)心刮刀收集會(huì)刮壞細(xì)胞，如果胰酶消化的程度掌握不好，也會(huì)讓細(xì)胞破損。胰酶消化可能會(huì)對某些膜蛋白產(chǎn)生影響，刮刀收集效率會(huì)略低，可根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)來選擇細(xì)胞收集的方式。做總蛋白提取時(shí)，可選擇直接在器皿中進(jìn)行裂解，無需提前收集。

 問題五：WB蛋白樣品堵孔  

可能原因：

1.脂類對濃縮膠點(diǎn)樣孔的堵塞。

2.樣品粘度高而引起的堵孔。

3.裂解不充分而引起的堵孔。

4.還原劑的失效而形成的蛋白復(fù)合物。

解決方案：

1.脂類對濃縮膠點(diǎn)樣孔的堵塞，可以將樣品靜置在冰上或4℃冰箱，讓脂類析出，從而去除脂類。

2.樣品粘度高而引起的堵孔，可以將樣品重新進(jìn)行超聲破碎，徹底地將樣品中的核酸打斷成小片段，從而降低樣品的粘度。

3.裂解不充分而引起的堵孔，在樣品變性之前，加入足量的裂解液，將樣品濃度降下來，才能夠打開蛋白質(zhì)聚集形成復(fù)合體。

4.還原劑的失效而形成的蛋白復(fù)合物，可以保存一段時(shí)間后的樣品再次使用前只需補(bǔ)加適量的還原劑重新煮樣就可以打開此類復(fù)合物了。

 問題六：細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮  

可能原因：

1.蛋白變性不徹底。

2.樣本濃度過高。

解決方案：

1.適當(dāng)提高SDS濃度，同時(shí)延長煮樣時(shí)間。

2.用水或PBS稀釋樣本。

 

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