高效的高通量篩選是一個(gè)包含樣品、化學(xué)、自動(dòng)化和數(shù)據(jù)分析的復(fù)雜系統(tǒng)。傳統(tǒng)的高通量系統(tǒng)利用6至1536孔板來(lái)支持產(chǎn)生可靠且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義研究所需的大量實(shí)驗(yàn)條件。當(dāng)前的技術(shù)需要大量投資在樣品和試劑上，并且根據(jù)正在研究的細(xì)胞類型，其應(yīng)用也會(huì)受到限制。

例如，多步驟處理（例如多次洗滌）的研究通常需要貼壁細(xì)胞，而懸浮細(xì)胞非常適合不需要洗滌（例如添加、混合、讀�。┑木�質(zhì)測(cè)定。在這里，我們展示了一個(gè)獨(dú)特的系統(tǒng)，該系統(tǒng)將 Curiox Biosystems 的 DropArray™ 板與 Formulatrix Tempest 的非接觸式、低容量自動(dòng)液體分配相結(jié)合，用于自動(dòng)處理貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。

關(guān)于CURIOX BIOSYSTEMS DROPARRAY™ 微孔板
DropArray™微孔板通過(guò)利用板平面表面的疏水性和親水性特性實(shí)現(xiàn)“無(wú)壁”液滴分離。以網(wǎng)格圖案排列在疏水基底上的親水島使分配的液滴“聚集”并保持樣品之間的分離。將液滴分配到特殊涂層的表面后，將不混溶的液體蓋密封液添加到板中，以防止交叉污染和液體蒸發(fā)。有關(guān)詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱 http://www.curiox.com/products.html。

關(guān)于 FORMULATRIX TEMPEST
Formulatrix Tempest是一款基于專有模塊化微流控芯片技術(shù)的非接觸式批量試劑分配器。它可配置為通過(guò)96個(gè)單獨(dú)控制的通道同時(shí)輸送多達(dá)12種成分的任何體積。DropArray技術(shù)得益于Tempest液體分配器的X-Y空間精度和精確的非接觸式分配功能。 Tempest獲得專利的微流體閥組使用正排量將離散體積的液體分配到96、384或1536孔板，且其不可回收死體積低至50µL�？蛇x的堆疊器和條形碼閱讀器為儀器增加了額外的靈活性。

FORMULATRIX

TEMPEST

方法和材料
I. 細(xì)胞系和試劑
COS-7 (非洲綠猴成纖維細(xì)胞樣腎細(xì)胞) 和人類前列腺上皮 (hPRE) 細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，并根據(jù) ATCC 建議進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)使用CD8+ T 細(xì)胞分離試劑盒 (130-094-156; Miltenyi Biotec) 從隨機(jī)健康供體的外周血中分離出人外周血單個(gè)核細(xì)胞 (PBMC) ，再?gòu)闹屑兓��?xì)胞毒性 T (CD8+ T) 細(xì)胞。

使用的抗體和染色劑如下：?jiǎn)慰寺】贵w APC 小鼠抗人CD8（555369；BD Biosciences）、Hoechst 33342 核酸染色劑（H-3570；Molecular Probes）、鬼筆環(huán)肽-四甲基羅丹明 B 異硫氰酸酯（P1951；Sigma-Aldrich） )、ZO-1 兔多克隆抗體 (61-7300;  Invitrogen) 和 Alexa Fluor ® 488 標(biāo)記的羊抗人 IgG (H+L) 抗體(A-11013; Invitrogen)。 

抗 CD3/CD19 雙特異性抗體產(chǎn)生于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，并如前所述從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化 (1)。內(nèi)吞抑制劑 Dynasore 水合物 (D7693; SigmaAldrich) 用于實(shí)時(shí)成像應(yīng)用。

使用了以下細(xì)胞活性測(cè)定試劑：CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (G7570; Promega)、CellTracker™ Green CMFDA (5-Chloromethylfluorescein Diacetate) (C7025; CMFDA; Molecular Probes)、溴化乙錠溶液 (EB; E1510; Sigma-Aldrich）、吖啶橙鹽酸鹽水合物熒光染料（AO；318337；Sigma-Aldrich）和碘化丙啶復(fù)染劑（PI；P3566；Molecular Probes）。

II. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
按照制造商的標(biāo)準(zhǔn)方案，通過(guò)使用FuGENE®6轉(zhuǎn)染試劑（E2691；Promega）以6µL的體積：在 OPTIMEM（31985-070；Invitrogen）中稀釋的(1µgDNA，用互補(bǔ)DNA（cDNA）轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。細(xì)胞在染色前培養(yǎng)48小時(shí)。

III. 細(xì)胞活性測(cè)定
在進(jìn)行特異性細(xì)胞活力測(cè)定之前，用不同濃度的單甲基 auristatin E (MMAE)（一種合成抗腫瘤劑）處理細(xì)胞 72 小時(shí)。對(duì)于 CellTiter-Glo® 測(cè)定，將 2 µL CellTiter-Glo® 液滴添加到 DropArray™ 板上的 2 µL 細(xì)胞液滴中。在室溫下培養(yǎng) 5 分鐘后，在 EnVision 2102 Multilabel Plate Reader (Perkin Elmer) 上讀取板。

對(duì)于基于熒光的分析，細(xì)胞用添加了 MMAE 的CellTracker™ Green CMFDA 進(jìn)行標(biāo)記。洗滌液滴以去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，然后用 IN CELL Analyzer 2000 (GE Healthcare Life Sciences) 對(duì)板進(jìn)行成像并使用 IN CELL Developer Toolbox v1.9 圖像分析軟件進(jìn)行分析。

IV. 免疫熒光染色
細(xì)胞用 4% 多聚甲醛固定 20 分鐘，用 1X 磷酸鹽緩沖液 (PBS) 洗滌，然后用 PBS/1% 牛血清白蛋白(BSA) 封閉 30 分鐘。

將細(xì)胞與 Fc 標(biāo)記的誘餌蛋白或人特異性抗體在 PBS/1% BSA 中培養(yǎng) 1 小時(shí)，用 1X PBS 洗滌并與適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記的二抗在室溫下培養(yǎng) 45 分鐘，然后用 1X PBS 洗滌 并成像。

V. 自動(dòng)化設(shè)備
除了 Curiox Biosystems 洗板機(jī)之外，用于處理 Curiox Biosystems DropArray™ 板的完整自動(dòng)化系統(tǒng)還包括控制Formulatrix Tempest、Dynamic Devices Oasis 和 Peak Analysis & Automation KiNEDx 機(jī)器人的 Overlord3 調(diào)度軟件。該系統(tǒng)通過(guò)各種免疫化學(xué)、轉(zhuǎn)染和細(xì)胞活性測(cè)定來(lái)處理貼壁和懸浮細(xì)胞，減少反應(yīng)體積，同時(shí)產(chǎn)生可靠的數(shù)據(jù)。

結(jié)果
傳統(tǒng)384孔板 vs. DropArray™ 板
DropArray™ 無(wú)壁孔板可實(shí)現(xiàn) 在384 孔板上的小體積貼壁和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。覆蓋 2 µL 細(xì)胞培養(yǎng)基液滴的培養(yǎng)油可避免蒸發(fā)并實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)條件（圖 1）。

使用 DropArray™ 技術(shù)對(duì)懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)定 
使用 Tempest 和 DropArray™ 技術(shù)測(cè)試了幾種細(xì)胞活性測(cè)定。使用標(biāo)準(zhǔn) 384-ul 板將反應(yīng)體積減少到總共 4 µL（2 µL 細(xì)胞和 2 µL CellTiter-Glo®），而不是40 µl（20 µL 細(xì)胞和 20 µL CellTiter-Glo®），與使用CellTracker™ Green CMFDA 進(jìn)行熒光活細(xì)胞染色相比，得出的半最大抑制濃度 (IC50)（圖 2）非常接近。這些結(jié)果表明，與需要較大體積試劑的傳統(tǒng)微孔板式方法相比，低體積的培養(yǎng)和測(cè)定條件產(chǎn)生了類似的結(jié)果。

圖 2. 洗滌細(xì)胞（熒光檢測(cè)）和不洗滌細(xì)胞（發(fā)光檢測(cè)）產(chǎn)生類似的 IC50 曲線。

使用 DropArray™ VS微量滴定板進(jìn)行細(xì)胞-表面蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究
DropArray™ 板在基于細(xì)胞的多步驟測(cè)定程序中的性能通過(guò)表達(dá)克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，以研究 IgLON 家族成員的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。使用優(yōu)化的洗滌條件 (2)，DropArray™ 技術(shù)與使用常規(guī)自動(dòng)洗滌程序的傳統(tǒng) 384 孔板進(jìn)行了比較。用邊緣系統(tǒng)相關(guān)膜蛋白(LSAMP) 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 COS-7 細(xì)胞（貼壁）、人胚腎 293T (HEK-293T) 細(xì)胞（半貼壁）和HEK-293S 細(xì)胞（懸浮適應(yīng)）， 人類神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 (hNT) 或阿片樣物質(zhì)結(jié)合蛋白/細(xì)胞粘附分子樣 (OPCML) 構(gòu)建體。

然后將表達(dá) LSAMP、hNT 或 OPCML 的細(xì)胞與誘餌蛋白一起培養(yǎng)。使用 Alexa Fluor ® 488 標(biāo)記的羊抗人IgG (H+L) 抗體檢測(cè) NEGR1-hFc 結(jié)合。與任一板格式的非轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的非特異性結(jié)合相比，觀察到響應(yīng)于 NEGR1-hFc 與 LSAMP、hNT 或 OPCML 的特異性結(jié)合，平均強(qiáng)度增加了 5 倍（圖 3B）。

圖 3. 基于細(xì)胞的細(xì)胞外蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。(A) 用 hNT 或 OPCML 表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的 COS-7 細(xì)胞被固定并與 NEGR1-hFc 誘餌蛋白一起培養(yǎng)。用抗人 AF488（綠色）洗滌和染色細(xì)胞，并用 IN Cell Analyzer 2000 掃描。在標(biāo)準(zhǔn) 384 孔微量滴定板和DropArray™ 板中使用相同的試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染和染色，以進(jìn)行直接比較。通過(guò)使用核的赫斯特染色（藍(lán)色）在兩種板格式中測(cè)量相似的細(xì)胞密度。比例尺 = 70 µm。 (B) 量化了采集圖像中綠色通道的平均強(qiáng)度。當(dāng) NEGR1-hFc 與表達(dá) NEGR1 結(jié)合配偶體的三種不同表達(dá)構(gòu)建體的三種不同細(xì)胞類型結(jié)合時(shí)，觀察到類似的強(qiáng)度值。以標(biāo)準(zhǔn) 384 孔板形式培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞系 (COS7) 產(chǎn)生了類似的值，但在標(biāo)準(zhǔn) 384 孔板形式的洗滌過(guò)程中去除了弱貼壁 (293T) 和懸浮適應(yīng) (293S) 細(xì)胞系。

在 384 孔板中未檢測(cè)到 NEGR1-Fc 與 LSAMP、hNT 或 OPCML 轉(zhuǎn)染的HEK293T或 S 細(xì)胞的結(jié)合，因?yàn)檫@些半貼壁和懸浮適應(yīng)細(xì)胞在洗滌過(guò)程中被去除（圖 3B）。然而，使用 DropArray™ 板和優(yōu)化的洗滌條件處理細(xì)胞導(dǎo)致 NEGR1-Fc 與LSAMP、HNThNT 或 OPCML 轉(zhuǎn)染的 HEK-293T 或HEK-293S 細(xì)胞結(jié)合，類似于 COS-7 細(xì)胞。

384 孔板與 DropArray™ 板每運(yùn)行 40 次的體積差異
DropArray™ 板和 Tempest 液體分配器系統(tǒng)使轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中使用的大多數(shù)試劑減少了 10 倍（表 1），從而顯著減少了試劑體積并顯著節(jié)省了每個(gè)樣品的成本。每個(gè)樣本的成本降低使得完成檢測(cè)的成本更低，并根據(jù)給定研究的總成本增加了可訪問(wèn)性。

表 1. DropArray™/Tempest 系統(tǒng)減少了試劑的使用量。將DropArray™ 板與 Tempest 液體分配器結(jié)合使用，可將所需的轉(zhuǎn)染試劑減少 90%。

總結(jié)
高通量篩選的挑戰(zhàn)是以最少的成本和精力有效地收集足夠的可靠數(shù)據(jù)。在這里，我們提出了新的儀器和實(shí)驗(yàn)室用具，這些儀器和用具減少了處理貼壁和非貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的同質(zhì)化測(cè)定、免疫熒光測(cè)定和轉(zhuǎn)染的成本和工作。利用Formulatrix Tempest和Curiox Biosystems的DropArray™板收集的數(shù)據(jù)與使用標(biāo)準(zhǔn)384孔板獲得的類似數(shù)據(jù)相比更有優(yōu)勢(shì)，但卻節(jié)省了大量的試劑，因此也節(jié)省了成本。集成自動(dòng)化平臺(tái)包括控制Formulatrix Tempest、Dynamic Devices Oasis和PAA KiNEDx機(jī)器人的Overlord3調(diào)度軟件。這個(gè)平臺(tái)提供了一個(gè)強(qiáng)大而可靠的系統(tǒng)，可以對(duì)貼壁、半貼壁和懸浮細(xì)胞進(jìn)行基于細(xì)胞的測(cè)定，大幅減少試劑，同時(shí)保有傳統(tǒng)高通量篩選板格式獲得的結(jié)果質(zhì)量。