介紹: 
核酸定量是分子生物學(xué)工作流程中的一個(gè)重要步驟，特別是對(duì)于qPCR 和下一代測(cè)序 (NGS) 等高級(jí)應(yīng)用而言。在 NGS 中，最終目標(biāo)是生成高度復(fù)雜的文庫(kù)，并以最大程度的深度和均一性進(jìn)行測(cè)序，因此準(zhǔn)確定量尤為重要。準(zhǔn)確測(cè)定核酸濃度的兩個(gè)關(guān)鍵步驟是：

1) 在最大酶效率對(duì) DNA 輸入量敏感的文庫(kù)制備前和 2) 在文庫(kù)制備后標(biāo)準(zhǔn)化樣品以在測(cè)序前匯集。此外，對(duì)越來(lái)越少的樣本輸入（例如，用于 RNA-seq 實(shí)驗(yàn)）的需求以及從許多常見樣本類型（如 FFPE 和ccfDNA）中分離核酸的挑戰(zhàn)使得濃度估計(jì)變得困難。

雖然存在多種定量方法，但基于熒光染料的系統(tǒng)因其靈敏度、目標(biāo)選擇性、成本和易用性而被推薦用于高級(jí)下游應(yīng)用。使用QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)，熒光染料原液被稀釋形成工作溶液，添加到含有少量體積的純化 DNA 樣品的微孔板中，并使用熒光計(jì)測(cè)量熒光。靈敏且準(zhǔn)確的 QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)可用于定量單管以及96 孔和 384 孔板中的 dsDNA。 

要保證小體積重復(fù)移液過程中的準(zhǔn)確性會(huì)是件困難的事，而且過程中勞動(dòng)密集，會(huì)出現(xiàn)失誤和代價(jià)高昂的返工情況。因此，大多數(shù)需要更高通量的實(shí)驗(yàn)室選擇用自動(dòng)化機(jī)器人液體處理平臺(tái)來(lái)進(jìn)行定量分析。MANTIS® 是一種新型臺(tái)式液體處理器，可滿足高通量試劑分配的許多要求，而其成本僅為大型系統(tǒng)的一小半。對(duì)于核酸定量，MANTIS®可準(zhǔn)確分配少量體積的 QuantiFluor® 染料工作溶液，以獲得可重現(xiàn)的定量結(jié)果。在本應(yīng)用說(shuō)明中，我們展示了 MANTIS® 液體處理器的兼容性，它可以快速準(zhǔn)確地自動(dòng)化進(jìn)行 96 孔和 384 孔板格式的 QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)的試劑處理。

所需材料

• MANTIS® 儀器 (Formulatrix)

• 大容量芯片 (Formulatrix Cat.# MCHS6)

• QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng) (Cat.# E2670)

• 無(wú)核酸酶水 (Cat.# P1195)

• 黑色平底 96 孔板(Corning Cat.# 3915) 或384 孔板(Corning Cat.# 3573)

• 15ml 或 50ml 錐形管

• 可測(cè)量熒光的多孔檢測(cè)儀 (e.g., GloMax Discover System [Cat.# GM3000])

實(shí)驗(yàn)方案: 

試劑制備: 

1. 制備 1X TE 緩沖液: 用無(wú)核酸酶水將 20X TE 緩沖液稀釋 20 倍。

2. 制備 QuantiFluor® dsDNA 染料工作溶液。

a. 96 孔格式：在 1X TE 緩沖液中按 1:400 稀釋 QuantiFluor® dsDNA 染料。有關(guān)詳細(xì)使用說(shuō)明，請(qǐng)參閱QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)技術(shù)手冊(cè) #TM346。

b. 384 孔格式：根據(jù)您所需的分析要求進(jìn)行染料稀釋。（請(qǐng)參閱使用 QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)進(jìn)行高通量、低體積 DNA 定量應(yīng)用說(shuō)明，了解如何選擇合適的染料稀釋度 。 ）這里我們?cè)?/span>1X TE 緩沖液中使用 1:200 稀釋的 QuantiFluor® dsDNA 染料來(lái)定量 0.05–50ng DNA。

3. 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線: 使用已知濃度的 dsDNA 標(biāo)準(zhǔn)品和 1X TE 緩沖液進(jìn)行連續(xù)稀釋，該緩沖液在任何未知樣品的濃度范圍上下延伸。對(duì)于空白樣品，使用 1X TE 緩沖液。

儀器設(shè)置: 

4. 打開 MANTIS® 桌面應(yīng)用程序并選擇“文件”>“新建分配列表”。從列表中選擇您的測(cè)定板。

5. 軟件將提示用戶將試劑添加到分配列表中。在“試劑名稱”字段中輸入“QuantiFluor dsDNA”，完成后選擇“確 定”。

6. 將 QuantiFluor dsDNA 分配到芯片位置 #1

7. 將 QuantiFluor® dsDNA 工作溶液置于芯片位置 #1 的試劑架中。將試管從芯片放入試劑中。

8. 充注芯片并設(shè)置新的液體分配，具體做法為選擇所需的孔并輸入所選孔的目標(biāo)體積

a. 96 孔格式：將 200 µl 工作溶液分配到每個(gè)孔中。

b. 384 孔格式：將 36 µl 工作溶液分配到每個(gè)孔中。

9. 將微孔板添加到 MANTIS®deck 并按下 。

分析測(cè)定：

10. 手動(dòng)將標(biāo)準(zhǔn)品、空白和未知樣品移液到多孔板各自的孔中。

c. 96-孔格式: 添加 1–20 µl 標(biāo)準(zhǔn)品、空白和未知樣品。

d. 384-孔格式: 添加 4µl 標(biāo)準(zhǔn)品、空白和未知樣品。

11. 使用搖板器或通過移液器移液每個(gè)孔中的液體將微孔板徹底混合。未能充分混合將導(dǎo)致孔之間的讀數(shù)變化。還要避免引入氣泡，這會(huì)干擾熒光。

12. 在室溫下培養(yǎng)測(cè)定物5 分鐘。

13. 檢測(cè)熒光 (504nmEx/531nmEm)。如果使用 GloMax® Systems 檢測(cè)儀器，請(qǐng)選擇預(yù)加載的方案：“QuantiFluor dsDNA 系統(tǒng)”。

14. 計(jì)算 dsDNA 濃度如下：從每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品熒光中去除空白樣品（1X TE 緩沖液）的熒光。使用來(lái)自DNA 標(biāo)準(zhǔn)的校正數(shù)據(jù)生成熒光與 DNA 濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過線性回歸或冪回歸確定標(biāo)準(zhǔn)曲線中任何未知樣品的 DNA 濃度。

標(biāo)準(zhǔn)化:

15. 來(lái)自 GloMax® 檢測(cè)儀器的濃度值可以直接導(dǎo)入 MANTIS® 軟件，以計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化所需的體積（參見圖 1 和圖2）。

圖 1. 使用 MANTIS® 液體處理器分配 96 孔板（圖 A）和 384 孔板（圖 B）中的 QuantiFluor® dsDNA 染料工作溶液，對(duì)K562 人類基因組 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品（Cat.# E4931）進(jìn)行定量。在 GloMax® Discover System 上測(cè)量熒光，并從冪回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插入未知樣品。

圖 2. 用于模擬 mRNA 轉(zhuǎn)錄本平均大小的 2,200bp PCR 產(chǎn)物的定量。 Mantis 液體處理器用于分配 96 孔板形式（圖 A）和384 孔板形式（圖 B）的 QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)。在 GloMax® Discover System 上測(cè)量熒光，并從冪回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)插入未知樣品。

總結(jié)
MANTIS® 液體處理器為研究人員提供了一個(gè)靈活的工作站，可在幾分鐘內(nèi)建立各種實(shí)驗(yàn)方案。精確執(zhí)行這些方案以提高實(shí)驗(yàn)室效率和實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性。本應(yīng)用說(shuō)明展示了液體處理軟件的易用性，它可快速無(wú)縫地過渡到自動(dòng)化平臺(tái)。使用 MANTIS® 液體處理器為 QuantiFluor® dsDNA 系統(tǒng)添加試劑可在多層微孔板中實(shí)現(xiàn)可重現(xiàn)的定量，幾乎無(wú)需儀器編程。