眾所周知，WB實驗是蛋白質(zhì)研究的基礎(chǔ)實驗之一。WB的操作看似簡單，做好確是不簡單的。要想取得漂亮的WB條帶，樣品的制備是前提保證。樣本制備是WB實驗的第一步也是最重要的一步，可分為樣本采集、樣本裂解、蛋白定量和蛋白變性四個步驟。在此過程中，大家會遇到各種奇奇怪怪的問題，這里給大家匯總了一些樣本制備過程中經(jīng)常遇到的問題及解決方案，為大家答疑解惑。

問題一：出現(xiàn)透明膠狀物  

可能原因：基因組復(fù)合物釋放出來

解決方案：

1.適當(dāng)超聲或使用1ml注射器反復(fù)抽吸可以打斷基因組DNA從而使粘稠感消失。

2.加入loading buffer煮沸變性的時候，可以稍微延長煮沸的時間，充分煮沸后一方面可以使結(jié)合在基因組DNA上的蛋白充分釋放，同時可導(dǎo)致基因組DNA的部分斷裂從而使粘稠感消失。

3.裂解的時候在裂解液中加入廣譜核酸酶。

 問題二：蛋白濃度低  

可能原因：

1.細胞或者組織量偏少。

2.樣本跟裂解液的比例不合適。

3.沒有充分裂解，或者裂解過程中蛋白降解。

解決方案：

1.增加樣本量。

2.根據(jù)樣本的量調(diào)整裂解液量。

3.裂解時間要充足，組織樣本要借助物理破碎，細胞樣本要吹打或者顛倒混勻，裂解液里要加酶抑制劑。

 問題三：上清漂浮一層油脂  

可能原因：樣本富含脂肪

解決方案：

1.裂解后樣本低溫靜置，吸出漂浮的油脂。

2.當(dāng)吸取依然達不到要求的時候,可以嘗試用二氧化硅吸附。

 問題四：貼壁細胞收集是刮下來還是胰酶消化  

解決方案：

兩種方式都是可行的，各有利弊。不必擔(dān)心刮刀收集會刮壞細胞，如果胰酶消化的程度掌握不好，也會讓細胞破損。胰酶消化可能會對某些膜蛋白產(chǎn)生影響，刮刀收集效率會略低，可根據(jù)自己的實驗來選擇細胞收集的方式。做總蛋白提取時，可選擇直接在器皿中進行裂解，無需提前收集。

 問題五：WB蛋白樣品堵孔  

可能原因：

1.脂類對濃縮膠點樣孔的堵塞。

2.樣品粘度高而引起的堵孔。

3.裂解不充分而引起的堵孔。

4.還原劑的失效而形成的蛋白復(fù)合物。

解決方案：

1.脂類對濃縮膠點樣孔的堵塞，可以將樣品靜置在冰上或4℃冰箱，讓脂類析出，從而去除脂類。

2.樣品粘度高而引起的堵孔，可以將樣品重新進行超聲破碎，徹底地將樣品中的核酸打斷成小片段，從而降低樣品的粘度。

3.裂解不充分而引起的堵孔，在樣品變性之前，加入足量的裂解液，將樣品濃度降下來，才能夠打開蛋白質(zhì)聚集形成復(fù)合體。

4.還原劑的失效而形成的蛋白復(fù)合物，可以保存一段時間后的樣品再次使用前只需補加適量的還原劑重新煮樣就可以打開此類復(fù)合物了。

 問題六：細胞提取液有的有沉淀，有的很清亮  

可能原因：

1.蛋白變性不徹底。

2.樣本濃度過高。

解決方案：

1.適當(dāng)提高SDS濃度，同時延長煮樣時間。

2.用水或PBS稀釋樣本。

 

艾普拜生物科技（蘇州）有限公司提供高質(zhì)量的Western blot解決方案，讓您可以專注于研究。在Western blot 樣本制備部分，我們有以下相關(guān)產(chǎn)品供大家訂購選擇：