N-亞硝胺類雜質(zhì)是一類分子中含有N-亞硝基結(jié)構(gòu)的化合物，它們常以痕量濃度存在于食品、煙草、消毒后的飲用水及塑膠制品中，在藥物的生產(chǎn)和制劑制備過(guò)程也會(huì)不可避免地會(huì)產(chǎn)生或者引入N-亞硝胺類雜質(zhì)。多種Ｎ-亞硝胺類雜質(zhì)具有遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)，可造成DNA損傷，進(jìn)而誘發(fā)癌癥。因此，需要對(duì)含有Ｎ-亞硝胺類雜質(zhì)的化合物進(jìn)行遺傳毒性檢測(cè)，評(píng)估其致突變性和致癌性風(fēng)險(xiǎn)。

N-亞硝胺類雜質(zhì)

N-亞硝胺類化合物（N-nitrosamines，NAs）是一類含有亞硝基官能團(tuán)，結(jié)構(gòu)通式為 R1（R2）N-N=O的化合物。其生成機(jī)制多樣，包括仲胺類化合物與亞硝酸之間的相互作用，叔胺類化合物與一氯胺之間的親核取代反應(yīng)，溶劑N，N-二甲基甲酰胺（DMF）的氧化，橡膠硫化劑與空氣中氮氧化合物相互作用等。

N-亞硝胺類化合物在自然界和食品中廣泛存在，如室外空氣、水、土壤、熏肉、烤肉、酒精飲料、谷物、奶制品、魚(yú)類、水果和蔬菜，但含量較少。在藥物的生產(chǎn)和制劑制備過(guò)程也會(huì)不可避免地會(huì)產(chǎn)生或者引入N-亞硝胺類雜質(zhì)。多種NAs具有遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)，即化合物存在DNA反應(yīng)活性，可造成無(wú)法修復(fù)的DNA損傷，甚至堿基突變，并可進(jìn)而引發(fā)癌癥。遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)通常與劑量無(wú)關(guān)，存在遺傳毒性的化合物可以在極低劑量水平下導(dǎo)致人體DNA損傷，且該損傷效應(yīng)可通過(guò)遺傳物質(zhì)的復(fù)制而不斷放大。

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）目前已批準(zhǔn)把十余種N-亞硝胺類化合物列入致癌物清單，其中N-亞硝基二甲胺（N-dimethylnitrosamine，NDMA）和N-亞硝基二乙胺（N-diethylnitrosamine，NDEA）被歸類為對(duì)人類致癌性證據(jù)有限，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致癌性證據(jù)充分的2A類致癌物；還有數(shù)種N-亞硝胺類化合物被歸類為對(duì)人類致癌性證據(jù)不足，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致癌性證據(jù)充分的2B類致癌物。此外，人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（International Coucil for Harmonization of Technical Requirement for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）評(píng)估和控制藥物中DNA反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)的 ICH M7指導(dǎo)原則將致癌風(fēng)險(xiǎn)高的NAs列為“關(guān)注隊(duì)列”，并基于已知的致癌和致突變數(shù)據(jù)，將其歸為“具有已知致癌致突變性”的Ⅰ類雜質(zhì)，需要得到最為嚴(yán)格的控制。

N-亞硝胺類雜質(zhì)（N-nitrosamines）產(chǎn)生強(qiáng)烈致癌性的遺傳毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)并非原型物質(zhì)，而是其代謝產(chǎn)物。在諸多N-亞硝胺類化合物致癌機(jī)制中，當(dāng)前最廣為接受的是ɑ-羥基化假說(shuō)，即Ｎ⁃亞硝胺ɑ-碳上的氫經(jīng)多種氧化酶和氧合酶（如細(xì)胞色素酶P450 CYP2E1和CYP2A6等）羥基化后可形成致癌物。Ｎ⁃亞硝胺首先被羥化酶激活生成α⁃羥基化亞硝胺，這是一種不穩(wěn)定且具有誘變性的中間體，可自發(fā)分解成甲醛和甲基重氮羥化物。甲醛可以依次氧化生成甲酸和二氧化碳，甲基重氮羥化物可以分解成烷基重氮離子，它可以與DNA堿基對(duì)反應(yīng)，使DNA堿基烷基化生成烷基鳥(niǎo)嘌呤并誘發(fā)致癌反應(yīng)。以NDMA為例，其具體致癌機(jī)理如圖１所示。
 
并非所有N-亞硝胺類化合物均存在致突變性。隨著對(duì)藥品中亞硝胺類雜質(zhì)控制的重視，明確某個(gè)亞硝胺類化合物是否具有致突變性是界定其監(jiān)管限度的關(guān)鍵，因此，需要對(duì)含有Ｎ-亞硝胺類雜質(zhì)的化合物進(jìn)行遺傳毒性檢測(cè)，評(píng)估其致突變性和致癌性風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)于N-亞硝胺類雜質(zhì)遺傳毒性檢測(cè)的增強(qiáng)Ames試驗(yàn)

Ames試驗(yàn)，又稱細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Bacterial Reverse Mutation Test)，于1975年建立并不斷發(fā)展完善，至今已成為國(guó)際上通用的遺傳毒理評(píng)價(jià)體系的必檢項(xiàng)目，同時(shí)也是許多遺傳毒理學(xué)新興技術(shù)發(fā)展過(guò)程中對(duì)照驗(yàn)證結(jié)果的試驗(yàn)之一，廣泛應(yīng)用于化合物的致突變性和潛在致癌性的初篩檢驗(yàn)。 EMA最新發(fā)布的“Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal product（EMA Q&As指南）”中提到，對(duì)N-亞硝胺而言，由于某些N-亞硝胺（如NDMA）在標(biāo)準(zhǔn)Ames試驗(yàn)的條件下靈敏度低，因此建議采用FDA國(guó)家毒理學(xué)研究中心提供的增強(qiáng)Ames試驗(yàn)（Enhanced Ames Test）的測(cè)定條件。因?yàn)镕DA認(rèn)為，用于Ames測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)方法可能不足以表征N-亞硝胺的致突變潛力，在某些情況下會(huì)產(chǎn)生已知致突變亞硝胺的陰性結(jié)果。對(duì)此，F(xiàn)DA國(guó)家毒理學(xué)研究中心一直在測(cè)試不同的條件，以開(kāi)發(fā)增強(qiáng)Ames測(cè)試（Enhanced Ames Test），旨在對(duì)N-亞硝胺雜質(zhì)潛在致突變性提供更可靠的評(píng)估。
以下為FDA提供的增強(qiáng)Ames試驗(yàn)（Enhanced Ames Test）條件：
 

試驗(yàn)菌株	包括鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA98, TA100, TA1535, TA1537和埃希氏大腸桿菌WP2 uvrA（pKM101）試驗(yàn)菌株
試驗(yàn)方法和預(yù)保溫時(shí)間	應(yīng)采用預(yù)保溫和非平板摻入法，建議預(yù)保溫時(shí)間為30分鐘。
S9的種類和濃度	增強(qiáng)Ames試驗(yàn)應(yīng)在包含30%大鼠肝S9和30%倉(cāng)鼠肝S9（Hamster Liver S9）中進(jìn)行。大鼠和倉(cāng)鼠的去線粒體上清液（S9s）應(yīng)用經(jīng)細(xì)胞色素P450酶誘導(dǎo)物質(zhì)（如苯巴比妥和β-萘黃酮組合物）處理的嚙齒類肝制備。
陰性（溶劑/賦形劑）對(duì)照	根據(jù)OECD 471指南，所用溶劑應(yīng)與Ames試驗(yàn)兼容�？捎玫娜軇┌�括但不限于：（1）水；（2）有機(jī)溶劑，如乙腈、甲醇和二甲基亞砜（DMSO）。 當(dāng)使用有機(jī)溶劑時(shí)，在預(yù)保溫混合物中應(yīng)盡可能采用較低的體積，并證明所用有機(jī)溶劑的量不干擾N-亞硝胺的代謝活化。
陽(yáng)性對(duì)照	根據(jù)OECD 471指南，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行菌種特異性陽(yáng)性對(duì)照。 在S9存在的情況下，已知具有誘變作用的兩種N-亞硝胺也應(yīng)作為陽(yáng)性對(duì)照。可用的N-亞硝胺陽(yáng)性對(duì)照包括：NDMA、1-環(huán)戊基-4-亞硝基哌嗪、NDSRI。
關(guān)于Ames測(cè)定的所有其他建議均應(yīng)遵循OECD 471指南

需要指出的是，如果在標(biāo)準(zhǔn)的Ames試驗(yàn)中產(chǎn)生了陽(yáng)性結(jié)果，則沒(méi)有必要使用增強(qiáng)的Ames試驗(yàn)條件進(jìn)行額外的試驗(yàn)。 如果標(biāo)準(zhǔn)Ames試驗(yàn)是陰性結(jié)果，則需要進(jìn)行增強(qiáng)Ames試驗(yàn)檢測(cè)。如果結(jié)果為陰性，還應(yīng)進(jìn)行體內(nèi)致突變性試驗(yàn)，因?yàn)閷＜页蓡T一致認(rèn)為，單一的體外突變?cè)囼?yàn)不足以評(píng)估N-亞硝胺化合物的致癌性。如果體內(nèi)致突變?cè)囼?yàn)結(jié)果也是陰性，則必須進(jìn)行專家知識(shí)和全面評(píng)估。在得出N-亞硝胺類化合物的非致突變性結(jié)論之前，應(yīng)徹底評(píng)估其致突變性，因此一些N-亞硝胺類雜質(zhì)是非致突變但致癌的，這一點(diǎn)必須要引起足夠重視。

IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

正如前文中提到的，N-亞硝胺類雜質(zhì)（N-nitrosamines）產(chǎn)生致癌性的遺傳毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)是其代謝產(chǎn)物，結(jié)合EMA 關(guān)于亞硝胺雜質(zhì)問(wèn)答文件中提到的“增強(qiáng)Ames試驗(yàn)需要使用大鼠肝S9和倉(cāng)鼠肝S9（Hamster Liver S9）作為代謝活化系統(tǒng)”，IPHASE作為體外研究生物試劑引領(lǐng)者，憑借先進(jìn)的設(shè)備，專業(yè)的技術(shù)人員和多年研發(fā)的經(jīng)驗(yàn)，繼成功研發(fā)誘導(dǎo)SD大鼠肝S9后，又成功開(kāi)發(fā)出國(guó)內(nèi)首家誘導(dǎo)倉(cāng)鼠（金黃地鼠）肝S9（Hamster Liver S9）。IPHASE誘導(dǎo)倉(cāng)鼠（金黃地鼠）肝S9是使用苯巴比妥鈉和β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)倉(cāng)鼠（金黃地鼠）的肝臟制備而成，經(jīng)過(guò)了無(wú)菌檢查、代謝活性檢測(cè)，并以Ames和染色體畸變?cè)囼?yàn)進(jìn)行質(zhì)控，結(jié)果顯示誘導(dǎo)倉(cāng)鼠（金黃地鼠）肝S9與誘導(dǎo)SD大鼠肝S9試驗(yàn)結(jié)果接近，說(shuō)明倉(cāng)鼠（金黃地鼠）肝S9符合標(biāo)準(zhǔn)，可滿足體外遺傳毒理試驗(yàn)需求。

此外，IPHASE現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出了遺傳毒性Ames試劑盒、體外染色體畸變?cè)噭┖械纫幌盗袑ｉT(mén)用于體外遺傳毒性研究的產(chǎn)品，助力廣大客戶進(jìn)行體外遺傳毒理學(xué)研究。
 

名稱	規(guī)格
誘導(dǎo)倉(cāng)鼠（金黃地鼠）肝S9	35mg/mL，1mL
誘導(dǎo)混合SD大鼠肝S9	35mg/mL，1mL
體外微核試驗(yàn)試劑盒	5mL*32 test
遺傳毒性Ames試劑盒	100/150/200/250 dishes
遺傳毒性Mini-Ames試劑盒	6孔板*24板/6孔板*40板
微量波動(dòng)Ames試劑盒	16*96 wells/ 4*384 wells
UMU遺傳毒性試劑盒	96 wells
TK基因突變?cè)噭┖?/td>	20ml*36 test
HGPRT基因突變?cè)噭┖?/td>	20ml*36 test
體外染色體畸變?cè)噭┖?/td>	5mL*30 test
彗星試驗(yàn)試劑盒	20/50 test

IPHASE/匯智和源憑借多年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，推出了多領(lǐng)域、多種類的高端科研試劑，為藥物早期研發(fā)提供篩選工具，為生命科學(xué)領(lǐng)域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學(xué)品等的遺傳毒性研究提供便捷產(chǎn)品，望廣大科研工作者來(lái)電咨詢，咨詢熱線400-127-6686。

參考資料：

[1] Questions and Answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5(3) of Regulation (EC) No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products.EMA,2024.

[2] 曹夢(mèng)茹，葉志偉，汪雋，等. 藥品中N-亞硝胺類有害雜質(zhì)[J]. 化學(xué)進(jìn)展，2023, 35(12): 1881-1894.

[3] 葉倩，耿興超，張河戰(zhàn)，等. 亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管策略及思考[J]. 中國(guó)藥事，2021, 35(2): 127-137.

[4] 葉倩，汪褀，文海若. 不同代謝活化條件對(duì) N-亞硝胺類化合物細(xì)菌回復(fù)突變結(jié)果的影響[J]. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2022, 17(2): 118-124.

[5] 于穎潔. 藥物中N-亞硝胺類雜質(zhì)的檢測(cè)方法研究[D]. 中國(guó)食品藥品檢定研究院. 2021.