實驗原理牙膏檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、pH值、需氧性質(zhì)等）培養(yǎng)后，1 g檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。所得結(jié)果包括本方法規(guī)定的條件下生長的嗜中溫需氧菌和兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。測定菌落總數(shù)便于判明樣品被細菌污染的程度，是對樣品進行衛(wèi)生學總評價的綜合依據(jù)。
 
二、實驗準備
1、儀器和設(shè)備
①  自動菌落計數(shù)儀SHASHIN KAGAKU，PSF-1100。
②  三角瓶：250 mL。
③  量筒：200 mL。
④  pH計或精密pH試紙
⑤  試管：18 mm×150 mm。
⑥  滅菌平皿：fluidot  FDT-9CM-2-S，直徑90 mm。
⑦  無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）FDT-SP01001
⑧  無菌吸管：10 mL（具0.1 mL刻度）FDT-SP01010
⑨  手動移液器：fluidot  1 mL  MSP1K
⑩  電動移液器：pipetty  1 mL  MSIC01-02-1000
⑪  吸頭：1.5mL   FDT-1500-1-TSF
⑫  酒精燈。
⑬  恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。
⑭  恒溫水浴箱。
⑮  高壓滅菌器。
⑯  蠕動泵分液器：fluidot  600D
⑰  自動液體分裝儀：fluidot  30001-PP
2、培養(yǎng)基和試劑
① SCDLP液體培養(yǎng)基
② 卵磷脂、吐溫80—營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基
制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80，將其他成分（除瓊脂外）加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，混勻，調(diào)pH值為7.1~7.4，加入瓊脂，121℃高壓滅菌20 min，儲存于冷暗處備用。
③ 0.5%氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC）
制法：溶解后過濾除菌，或115℃高壓滅菌20 min，裝于棕色試劑瓶，置4℃冰箱備用。
  
三、實驗步驟
1、用滅菌吸管吸取1:10的檢液2 mL，分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1 mL。另取1 mL注入到9 mL SCDLP液體培養(yǎng)基（或經(jīng)過驗證等效或優(yōu)于SCDLP的稀釋液）試管中（注意勿使吸管接觸液面），并充分混勻，制成1:100檢液，更換一支吸管，吸取2 mL，分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1 mL。樣品至少需進行1:10和1:100稀釋，如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000，1:10000，……等，每個稀釋度應(yīng)換1支吸管。
2、將融化并冷至45℃~50℃的卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約15 mL，隨即轉(zhuǎn)動平皿，使檢液與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h±2 h。同時吸取1 mL空白稀釋液加入滅菌空平皿中，加入約15 mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h±2 h，為空白對照。
3、為便于區(qū)別牙膏中的顆粒與菌落，可在每100 mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂中加入1 mL 0.5%的TTC溶液，如有細菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而牙膏的顆粒顏色無變化。
 

• 菌落計數(shù)方法

1、在自動菌落計數(shù)儀上按照表一的數(shù)值，設(shè)置好條件。
2、使用自動菌落計數(shù)儀，快速識別重疊或模糊的菌落，1-3秒出結(jié)果后保存，繼續(xù)識別其它的培養(yǎng)皿，直到所有培養(yǎng)皿計算完畢。
 
 

• 菌落計數(shù)及報告方法

1、首先選取平均菌落數(shù)在30~300之間的平皿，作為菌落總數(shù)測定的范圍。當只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例1）。
2、若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30~300之間， 則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來決定，若其比值小于或等于2，應(yīng)報告其平均數(shù)，若大于2則以其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)報告之（見表1中例2及例3）。
3、若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例4）。
4、若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1例5）。
5、若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30~300之間，其中一個稀釋度大于300，而相鄰的另一稀釋度小于30時，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例6）。
6、若所有的稀釋度均無菌生長，報告數(shù)為每g小于10 CFU。
7、菌落計數(shù)的報告，菌落數(shù)在10以內(nèi)時，按實有數(shù)值報告之，大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計算。為了縮短數(shù)字后面零的個數(shù)，可用10的指數(shù)來表示（見表1報告方式欄）。在報告菌落數(shù)為“不可計”時，應(yīng)注明樣品的稀釋度。
 
表1  細菌計數(shù)結(jié)果及報告方式

例次	不同稀釋度平均菌落數(shù) 10-1     10-2     10-3	兩稀釋度 菌數(shù)之比	菌落總數(shù) （CFU/g）	報告方式 （CFU/g）
1	1365    164     20	─	16400	16000或1.6×104
2	2760    295     46	1.6	38000	38000或3.8×104
3	2890    271     60	2.2	27100	27000或2.7×104
4	不可計  4650    513	─	513000	510000或5.1×105
5	27      11      5	─	270	270或2.7×102
6	不可計  305     12	─	30500	31000或3.1×104
7	0       0       0	─	＜1×10	＜10

注：CFU-菌落形成單位。
8、以CFU/g 為單位報告。