在神經(jīng)科學(xué)研究中，深入了解大腦的活動機制一直是科學(xué)家們的追求目標(biāo)。傳統(tǒng)的雙光子顯微鏡在成像時存在一些局限性，例如采樣速度、空間分辨率和視場之間的權(quán)衡，以及單光束掃描策略導(dǎo)致的成像通量限制和盲掃描策略帶來的低效和熱損傷問題。

為了解決這些問題，研究團(tuán)隊一直在探索新的自適應(yīng)采樣策略。

近日，加州大學(xué)戴維斯分校的研究團(tuán)隊研發(fā)出一種新型的雙光子熒光顯微鏡，為高速大腦成像帶來了新的突破。

原理與特點

研究團(tuán)隊的顯微鏡使用了自適應(yīng)線激發(fā)的采樣方案，其工作原理是用動態(tài)圖案匹配神經(jīng)元細(xì)胞體局部結(jié)構(gòu)的短線照射腦組織。通過數(shù)字微鏡設(shè)備（DMD）對激發(fā)線進(jìn)行空間調(diào)制，使其只捕獲圖像平面中的感興趣區(qū)域（ROI，即神經(jīng)元細(xì)胞體）而非背景區(qū)域。

DMD在這個過程中起到了關(guān)鍵作用，它作為強度調(diào)制器，加載與神經(jīng)元細(xì)胞體形態(tài)匹配的二進(jìn)制掩模，位于樣本平面的共軛平面。飛秒激光（920nm）先被整形為線，通過諧振掃描儀（8kHz）和振鏡掃描到DMD上，DMD反射的光攜帶ROI的相關(guān)信息，通過中繼系統(tǒng)、管透鏡和物鏡光學(xué)中繼到樣本平面以成像腦組織。

這種自適應(yīng)線激發(fā)方案具有多個顯著特點。首先，它單次測量采樣區(qū)域更大，減少了成像中的行數(shù)，從而提高了幀率。例如，在實驗中，他們將激發(fā)線的長度在樣本平面上塑造為約11.5μm（1/e²），與小鼠大腦中神經(jīng)元細(xì)胞體的直徑相似（10-15μm）。這樣既能保證快速成像速度，又能保持細(xì)胞分辨率，避免相鄰神經(jīng)元之間的過度信號串?dāng)_。

同時，該方法還對圖像進(jìn)行了有效的預(yù)處理，將盲采樣方法記錄的圖像中的像素進(jìn)行凝聚，大多屬于單個源，減少了數(shù)據(jù)量和后續(xù)數(shù)據(jù)處理（分割和提取時間活動軌跡）的計算時間。

其次，該方案能獨家采樣神經(jīng)元細(xì)胞體，避免背景區(qū)域的不必要激發(fā)，從而大大降低了輸送到腦組織的總激光功率和熱損傷。盡管激發(fā)線�。�2.0μm，半高全寬，F(xiàn)WHM），軸向PSF的FWHM約為16.5μm，但在保持細(xì)胞分辨率的同時有效地避免了相鄰神經(jīng)元之間的過度信號串?dāng)_。

實驗設(shè)置和結(jié)果

為了驗證該方案的有效性，研究團(tuán)隊進(jìn)行了一系列實驗。在模擬實驗中，研究團(tuán)隊在模擬鈣成像數(shù)據(jù)集中模擬了自適應(yīng)線激發(fā)采樣過程。結(jié)果表明，CalmAn（一種約束非負(fù)矩陣分解算法）成功分割了神經(jīng)元的空間足跡，提取的時間軌跡與地面實況具有高皮爾遜相關(guān)系數(shù)，神經(jīng)元信號通�？梢詮目臻g重疊的神經(jīng)元中分離出來。這說明自適應(yīng)線采樣記錄保留了與原始高分辨率記錄相同的信息，且計算資源需求顯著降低。

在驗證實驗中，通過熒光幻影樣本驗證了DMD的光束圖案能力和自適應(yīng)采樣的概念。實驗結(jié)果表明，圖像記錄與二進(jìn)制掩模匹配良好，驗證了DMD與樣本平面的共軛關(guān)系以及與樣本結(jié)構(gòu)的良好對齊，進(jìn)一步驗證了DMD與樣本結(jié)構(gòu)之間強大的映射關(guān)系。

在活體實驗中，研究團(tuán)隊在活體清醒小鼠中進(jìn)行實驗，小鼠初級視覺皮層（V1）的2/3層轉(zhuǎn)染了鈣指示劑GCaMP6f。

實驗結(jié)果顯示，采樣策略減少了諧振掃描儀掃描的行數(shù)，從而將幀率提高到198Hz（FOV為500μm×695μm），顯著高于傳統(tǒng)雙光子顯微鏡；使用自適應(yīng)采樣策略時，激光功率顯著降低（比無自適應(yīng)采樣時小約14倍），平均激光功率僅為約1.5mW，避免了對小鼠大腦的熱損傷；同時，成功提取了單個ROI的時間活動軌跡，并在深度為450μm的皮層中成功提取了91個ROI。

此外，該方法還具有良好的兼容性和可擴展性。它與許多其他光束復(fù)用技術(shù)兼容，可進(jìn)一步提高成像通量。通過適當(dāng)設(shè)置和循環(huán)DMD模式，顯微鏡在不物理修改光學(xué)設(shè)置的情況下，保留了等效點掃描高分辨率成像的能力。

不過，當(dāng)前的點擴散函數(shù)（PSF）可能導(dǎo)致成像神經(jīng)元細(xì)胞體時出現(xiàn)離焦背景，未來可以通過進(jìn)一步收緊光束的軸向范圍或使用矩陣分解算法捕獲細(xì)胞體附近的背景信號并將其去除來優(yōu)化。

與其他類似線掃描策略相比，該方法避免了在成像深度、計算資源或系統(tǒng)設(shè)置方面的挑戰(zhàn)。與SLAP2相比，有效插入損耗較低，可使用更常見和成本效益更高的80MHz飛秒激光。

總結(jié)與展望

總的來說，這種新型的雙光子顯微鏡具有硬件簡單、不需要調(diào)制器和掃描儀同步等優(yōu)勢，同時通過結(jié)合光束復(fù)用技術(shù)和使用更快的諧振掃描儀，成像速度可達(dá)到千赫茲，適用于電壓成像，也可用于三維/體積成像和成像具有更精細(xì)特征的ROI，如樹突和棘突。

這項研究為神經(jīng)科學(xué)研究提供了一種強大的工具，有助于我們更深入地了解大腦的活動機制。期待未來能有更多的研究成果基于此技術(shù)展開，為人類健康和科學(xué)發(fā)展帶來更多的福祉。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于:Yunyang Li,Shu Guo,Ben Mattison,Junjie Hu,Kwun Nok Mimi Man,and Weijian Yang, "High-speed two-photon microscopy with adaptive line-excitation,"Optica 11,1138-1145(2024)