熒光強(qiáng)度分析是論文常用技能之一，它可以量化熒光強(qiáng)度，從而進(jìn)行對(duì)比分析或統(tǒng)計(jì)分析，得出可信的結(jié)果。今天我們就來介紹下如何用明美顯微數(shù)碼測(cè)量分析系統(tǒng)和ImageJ快速實(shí)現(xiàn)徑向熒光強(qiáng)度分析。

近期聚苯乙烯納米顆粒論文中使用的熒光強(qiáng)度分析①

一、能量曲線工具

能量曲線工具在右下角

能量曲線是明美顯微數(shù)碼測(cè)量分析系統(tǒng)的工具之一，它可以直觀呈現(xiàn)徑向直線上熒光強(qiáng)度變化，具有方便易用，結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn)。

能量曲線使用效果

能量曲線使用非常簡(jiǎn)單，選中工具后可以在成像窗口或圖片上畫線，然后系統(tǒng)就會(huì)在線上生成一個(gè)曲線圖，紅藍(lán)綠三色熒光分別呈現(xiàn)為紅藍(lán)綠三色曲線。曲線圖以用戶畫的線為X軸，以光強(qiáng)為Y軸，Y軸有100%和50%兩條線，可快速估算熒光強(qiáng)度。

紅色熒光上使用效果

能量曲線在單色熒光中，可用于快速判斷熒光強(qiáng)度，從而進(jìn)行對(duì)比獲得科研靈感，或用于曝光控制，避免ROI的目標(biāo)過度曝光導(dǎo)致重要的細(xì)節(jié)信息丟失。而在多色熒光中，能量曲線還可以用于快速判斷熒光共定位情況。

二、ImageJ/FIJI量化分析

FIJI直線工具

能量曲線方便易用，直觀快速但不夠量化，要更量化地進(jìn)行徑向熒光強(qiáng)度分析，需要用到ImageJ或者說FIJI（JIFI是更新版的ImageJ）.首先打開熒光圖片，使用直線工具畫線，注意畫線對(duì)比時(shí)長(zhǎng)度數(shù)據(jù)要一致。

轉(zhuǎn)換為8bit圖像

我們這個(gè)熒光圖是單色熒光，因此我們這里先將其轉(zhuǎn)化成8bit格式，減少其他通道信號(hào)可能帶來的問題，在菜單選項(xiàng)選擇Image-Type-8bit.

打開Plot Profile

下一步打開Plot Profile，可以從菜單Analyze-Plot Profile打開，也可以直接按鍵盤的K鍵打開，打開后會(huì)呈現(xiàn)直線光強(qiáng)的曲線圖。

保存數(shù)據(jù)

點(diǎn)擊曲線圖窗口的Data-Save Data，可以將數(shù)據(jù)導(dǎo)出成CSV格式，然后就可以用Excel或者Origin之類工具打開進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析或者曲線圖繪制了。

復(fù)制全部數(shù)據(jù)

除了Data-Save Data導(dǎo)出成文件以外，還能使用Data-Copy All Data將數(shù)據(jù)復(fù)制到剪切板，然后直接在已經(jīng)打開的Excel中進(jìn)行粘貼，減少保存多個(gè)數(shù)據(jù)文件的麻煩。

Excel中曲線圖繪制

一個(gè)小提醒，如果想在Excel里做出像上面論文的圖片，可能還需要經(jīng)過數(shù)據(jù)處理，前列是像素，需要根據(jù)軟件標(biāo)尺換算成尺寸，通常是μm；后列是熒光強(qiáng)度，因?yàn)閿?shù)據(jù)是8bit的，因此數(shù)值是0-255，按255為100%做個(gè)換算來畫Y軸。

今天的文章分享就到這里，希望對(duì)大家的日常工作有幫助，如您有想了解的使用技巧，也歡迎向我們提出。

引用文獻(xiàn)：

①Sun, H., Yang, B., Li, Q. et al. Polystyrene nanoparticles trigger aberrant condensation of TDP-43 and amyotrophic lateral sclerosis-like symptoms. Nat. Nanotechnol. (2024). https://doi.org/10.1038/s41565-024-01683-5