急性肝功能衰竭發(fā)病迅速，致死率高。緊急肝移植仍然是常見的治療方案，因此迫切需要有效的促再生療法，利用和增強肝臟固有的再生修復(fù)能力。然而，關(guān)于肝臟在壞死性炎癥性肝損傷后恢復(fù)正常的微結(jié)構(gòu)，從而恢復(fù)腸肝屏障功能的機制，所知有限。為此，本研究利用單細胞核轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，揭示了傷口閉合和肝細胞增殖之間的脫鉤，并發(fā)現(xiàn)了一種介導(dǎo)肝損傷后傷口閉合的新型遷移肝細胞亞群，為肝再生研究領(lǐng)域提供寶貴的資料。

文章詳情

文章題目：Multimodal decoding of human liver regeneration
中文題目：人肝臟再生的多模態(tài)解碼
發(fā)表時間：2024.06
期刊名稱：Nature
影響因子：50.5
實驗平臺：10x Genomics 單細胞核轉(zhuǎn)錄組測序+Visium空間轉(zhuǎn)錄組測序
DOI：10.1038/s41586-024-07376-2

01 研究思路

 
02 研究內(nèi)容

1. 人肝損傷后肝細胞空間轉(zhuǎn)錄圖譜

對乙酰氨基酚（APAP）誘導(dǎo)的急性肝功能衰竭（APAP-ALF）和非A–E型肝炎急性肝功能衰竭（NAE-ALF）的肝細胞增殖顯著增加，這種肝細胞增殖的增加與患者年齡無關(guān)。因此，本次人肝臟再生研究重點關(guān)注APAP-ALF和NAE-ALF。對健康人和APAP-ALF患者的肝樣本進行了空間轉(zhuǎn)錄組分析，重現(xiàn)了APAP-ALF與對照組中肝細胞和肌成纖維細胞的拓撲結(jié)構(gòu)。利用SPATA算法在健康人的空間結(jié)果中繪制跨區(qū)域的軌跡曲線，以識別在整個小葉中差異表達的基因，獲得了可用于空間分區(qū)的基因模塊。將這些分區(qū)基因模塊應(yīng)用于APAP-ALF樣本，發(fā)現(xiàn)了肝細胞門靜脈-中央極性的喪失，并出現(xiàn)了同時具有門靜脈和中央特征的肝細胞。富集分析發(fā)現(xiàn)在APAP-ALF樣本的殘余存活區(qū)域中存在混合的與門靜脈和中央相關(guān)的GO 術(shù)語，與壞死周圍區(qū)域和壞死區(qū)域中的不同。這些結(jié)果表明，殘存的人肝細胞表現(xiàn)出功能上的可塑性，以補償APAP-ALF后中央肝細胞的大量損失。

Fig.1 解構(gòu)人肝臟再生圖譜

 
2. 人肝再生過程中的遷移性肝細胞特征及其保守性

對健康（n = 9）、APAP-ALF（n = 10）和NAE-ALF（n = 12）人肝組織進行了單細胞核RNA測序（snRNA-seq），捕獲到了大量肝實質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)錄組信息。從單細胞結(jié)果中觀察到在APAP-ALF和NAE-ALF后肝細胞分區(qū)的破壞和強烈的增殖性轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)。對肝細胞進行再聚類發(fā)現(xiàn)了一個主要存在于APAP-ALF和NAE-ALF的ANXA2+亞群，富集分析發(fā)現(xiàn)其具有遷移細胞表型。將ANXA2+肝細胞亞群中差異表達的基因定義為遷移性肝細胞特征，在APAP-ALF和NAE-ALF的壞死區(qū)域及其周圍觀察到了這一特征。APAP-ALF壞死區(qū)域鄰近的肝細胞亞群中表達遷移性肝細胞特征，而健康肝組織中則不存在。免疫熒光染色證實，與對照組相比，APAP-ALF和NAE-ALF肝臟中的ANXA2+肝細胞顯著增加，并且在APAP-ALF的壞死周圍區(qū)域（PNR）中ANXA2+肝細胞數(shù)量增加。ANXA2+肝細胞表現(xiàn)出具有皺褶膜和延伸的板狀偽足，這是遷移細胞的特征。細胞互作分析發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)細胞和膽管細胞亞群是與ANXA2+肝細胞發(fā)生互作的主要細胞類型。對一組急性嚴重肝損傷患者的肝細胞ANXA2表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)ANXA2+肝細胞在PNR中富集。在其他人急性肝衰竭和慢性肝病的組織中，也觀察到了這種ANXA2+肝細胞亞群。

對APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型進行snRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析（包含多個時間點），將人遷移性肝細胞特征應(yīng)用于小鼠肝細胞，鑒定到一種類似的ANXA2+亞群，具有相似的遷移功能，分布在壞死區(qū)域周圍，具有皺褶的細胞膜和板狀偽足。在雄性和雌性小鼠中，APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷后ANXA2+肝細胞數(shù)量增加，富集在PNR中�；プ鞣治霭l(fā)現(xiàn)肌成纖維細胞可能通過與TGFβ信號通路相關(guān)的多種互作關(guān)系，與遷移性肝細胞亞群發(fā)生互作。

Fig.2 再生中的遷移性肝細胞特征

 
3. 傷口閉合先于肝細胞增殖

在研究APAP誘導(dǎo)的小鼠肝損傷后肝再生動態(tài)時，研究者發(fā)現(xiàn)傷口閉合（通過壞死區(qū)域百分比評估）與肝細胞增殖之間存在時間上的脫節(jié)，傷口閉合在肝細胞增殖開始之前發(fā)生。為了評估肝細胞在中央靜脈周圍壞死區(qū)域的再生是否主要通過增殖驅(qū)動，對肝損傷后的小鼠中增殖肝細胞進行標記，發(fā)現(xiàn)中央靜脈周圍壞死區(qū)域中大多數(shù)肝細胞并非來源于肝細胞的增殖。因此，研究者猜測上文鑒定到的ANXA2+肝細胞亞群可能遷移到壞死區(qū)域中。使用4D活體顯微鏡（IVM）證實肝細胞遷移是APAP誘導(dǎo)的肝損傷后創(chuàng)傷閉合的主要機制，并且創(chuàng)傷閉合不是通過肝細胞肥大介導(dǎo)的。

Fig.3 傷口閉合先于肝細胞增殖

 
4. 肝細胞ANXA2調(diào)節(jié)傷口閉合 

ANXA2已經(jīng)確定為人和小鼠遷移性肝細胞的關(guān)鍵標志物。在一個劃痕實驗中，敲低人肝細胞癌細胞系（Huh7）中ANXA2的表達，降低了傷口愈合能力。未受傷小鼠肝臟的原代肝細胞在培養(yǎng)后增加了Anxa2基因的表達水平。為了確定在APAP誘導(dǎo)的小鼠肝損傷中肝細胞ANXA2的功能作用，在小鼠模型進行體內(nèi)敲低肝細胞中的Anxa2，這使得APAP誘導(dǎo)的小鼠肝損傷后的傷口愈合受阻，這種影響不是通過減少肝細胞增殖或持續(xù)肝細胞損傷介導(dǎo)的。小鼠PNR區(qū)域中的肝細胞缺乏膜F-肌動蛋白，比對照組小鼠更為圓形，顯示出減少的遷移表型。與對照組相比，敲低組并未影響APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷期間白細胞（CD45+）、間質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞中的Anxa2表達，并且兩組的白細胞、間質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞總數(shù)相似。總之，這些結(jié)果表明在傷口閉合和肝細胞增殖之間存在時間上的脫節(jié)，并且肝細胞ANXA2表達調(diào)節(jié)APAP誘導(dǎo)的肝再生過程中的肝細胞遷移和傷口閉合。

Fig.4 肝細胞ANXA2調(diào)節(jié)傷口閉合
 

03 主要結(jié)論 
 
本研究對健康和肝功能衰竭（ALF）外植體肝臟組織進行單細胞核轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組測序，生成人類肝臟再生的單細胞全譜系圖譜并發(fā)現(xiàn)了一種在人類肝臟再生過程中出現(xiàn)的新型ANXA2+遷移性肝細胞亞群，以及對乙酰氨基酚 (APAP) 誘導(dǎo)的肝再生小鼠模型中的相關(guān)亞群。在小鼠APAP誘導(dǎo)的肝損傷后，在多個時間點對壞死性傷口閉合和肝細胞增殖的研究表明，傷口閉合先于肝細胞增殖。肝細胞 ANXA2 的消耗可減少肝細胞生長因子誘導(dǎo)的人和小鼠肝細胞體外遷移，并消除 APAP 誘導(dǎo)的小鼠肝損傷后的壞死傷口閉合。這些結(jié)果揭示了傷口閉合與肝細胞增殖之間的脫鉤，并發(fā)現(xiàn)了一種新的遷移性肝細胞亞群，該亞群介導(dǎo)肝損傷后的傷口閉合。促進正常肝臟微結(jié)構(gòu)快速重建和腸肝屏障修復(fù)的療法，可能會推動再生醫(yī)學(xué)治療發(fā)現(xiàn)的新領(lǐng)域。

參考文獻

Matchett KP, Wilson-Kanamori JR, Portman JR, et al. Multimodal decoding of human liver regeneration. Nature. 2024;630(8015):158-165.