在多肽相關(guān)研究中，通過(guò)固相多肽合成（SPPS）和多肽純化的方法，我們可以獲得高質(zhì)量的多肽。但是，在實(shí)際應(yīng)用中，特別是在癌癥免疫治療方面，我們通常需要快速獲得一批新抗原肽，以縮短藥物生產(chǎn)周期，而傳統(tǒng)方法耗時(shí)長(zhǎng)效率低。因此，在保證獲得高質(zhì)量新抗原肽的同時(shí)，進(jìn)一步縮短獲得新抗原肽的時(shí)間，成為多肽研究新的挑戰(zhàn)和目標(biāo)。

傳統(tǒng)研究方法中多肽合成和純化兩個(gè)流程是分開(kāi)進(jìn)行的。對(duì)于需要一次獲得大量的新抗原肽而言，傳統(tǒng)固相多肽合成（SPPS）方法批量合成多肽的過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，而且，傳統(tǒng)的多肽純化方法——高效液相色譜法（HPLC），單次只能純化一個(gè)多肽，批量多肽的純化需要依次進(jìn)行，并且大多數(shù)新抗原肽是中長(zhǎng)肽或疏水性強(qiáng)的復(fù)雜多肽，這對(duì)HPLC而言是一大挑戰(zhàn)。所以，傳統(tǒng)多肽研究方法獲得大量新抗原肽的總體效率和質(zhì)量都不高。

本文提出一種腫瘤新抗原肽合成和純化一體化解決方案，¹該方案在同一臺(tái)儀器上將多肽合成和純化的過(guò)程結(jié)合，利用一種全新的多肽純化方法，實(shí)現(xiàn)高通量復(fù)雜多肽的平行純化。這種一體化解決方案，一方面可以極大縮短批量獲得新抗原肽的時(shí)間，不到24小時(shí)即可獲得6個(gè)純化后的多肽，另一方面還極大提高復(fù)雜肽純化的純度和質(zhì)量，單次純化平均純度高達(dá)84%。

PurePep解決方案關(guān)鍵點(diǎn)
1 感應(yīng)加熱合成多肽
本研究選擇了17個(gè)不同疏水性和長(zhǎng)度的新抗原肽（P01-P17），包括6個(gè)已有文獻(xiàn)記載的合成和純化都具有很大挑戰(zhàn)性的困難多肽（P12-P17）。^2,3合成（0.1mmol）步驟如下：

• 偶聯(lián)：加入DIC/Oxyama，90℃條件下反應(yīng)3分鐘；
• 封端：加入Ac₂O/Pyr，50℃條件下反應(yīng)2分鐘；
• Fmoc-脫保護(hù)：加入DMF/Pip，90℃條件下反應(yīng)1分鐘。

表 1 本研究中使用的新抗原肽序列。*指在室溫下進(jìn)行的合成

2 自動(dòng)PEC多肽純化

• PEC-Linker在同時(shí)加入Oxyma/DMF條件下，60℃反應(yīng)15分鐘；
• TFA切割常溫下進(jìn)行2小時(shí)（83:5:5:5:2 TFA/H₂O/PhSH/EDT/TIS）;
• PEC純化常溫下進(jìn)行5.2小時(shí)（通用性方法）。

表 2 所有新抗原肽合成后產(chǎn)量和純度以及使用PEC純化后產(chǎn)量和純度（UV280）

3 利用HPLC進(jìn)行精純

• Knauer Semi-prep. HPLC，15×2 cm C18柱；
• 2ml Loop進(jìn)樣環(huán)，10-60％MeCN 30分鐘。

表 3 P12-P17肽在使用感應(yīng)加熱-SPPS（IH）、IH+PEC、IH+HPLC和IH+PEC+HPLC后獲得的純度（UV280）。綠色表示IH-SPPS+HPLC具有更高的純度。³

PurePep解決方案優(yōu)勢(shì)

1 PurePep Chorus快速合成多肽

• PurePep Chorus（圖1）結(jié)合感應(yīng)加熱進(jìn)行多肽合成（IH-SPPS），并且支持同一臺(tái)儀器上進(jìn)行多肽切割和純化；
• 利用感應(yīng)加熱每個(gè)合成循環(huán)17分鐘（圖2），每組5-6個(gè)肽的合成總時(shí)間為2.5-7.4小時(shí)（包括封端）；
• 感應(yīng)加熱可合成常溫合成失敗的多肽（表3）。

圖 1 PurePep Chorus全自動(dòng)多肽合成儀
 

圖 2 反應(yīng)器感應(yīng)加熱

2 PurePep Chorus自動(dòng)純化多肽

• 使用PEC自動(dòng)試劑盒（圖4）進(jìn)行PEC正交純化，獲得PEC級(jí)肽，平均純度達(dá)到84%，高于HPLC（表2）；
• PEC純化法（圖6）允許使用DMSO或HFIP溶劑，從而可以進(jìn)行從SPPS到純化的可靠處理；
• 在5.2小時(shí)內(nèi)自動(dòng)純化6個(gè)多肽，純化后的多肽儀器可自動(dòng)收集（圖5），全過(guò)程實(shí)際手動(dòng)操作的時(shí)間僅為36分鐘；
• PEC純化后結(jié)合HPLC進(jìn)行精純（表3），平均純度大于90%，包括報(bào)道的低合成效率低純化效率序列。

圖 4 PEC自動(dòng)純化試劑盒套件

圖 5 加載瓊脂糖的45 mL反應(yīng)器，左側(cè)的收集瓶可收集純化的多肽
 

圖 6 PEC多肽純化化學(xué)反應(yīng)步驟，利用通用PEC-連接子系統(tǒng)連接目標(biāo)肽以及“Catch & Release"技術(shù)無(wú)痕安全釋放目標(biāo)肽。

參考文獻(xiàn)
1. R. Zitterbart et al. Chem Sci 2021, 12, 2389
2. N Hilf et al. Nature 2019, 565, 240
3. N. L. Truex, B. Pentelute et al. Sci Rep 2020, 10, 723