編者按

CosMx SMI是一種全新的空間轉(zhuǎn)錄/蛋白質(zhì)組檢測技術(shù)。與傳統(tǒng)空間分子檢測技術(shù)相比，其具有分辨率高（亞細(xì)胞水平）和靶標(biāo)多（轉(zhuǎn)錄組可檢測多達(dá)6000種基因）的優(yōu)勢，結(jié)合圖像分析算法進(jìn)行細(xì)胞分割，獲得“單細(xì)胞”的空間轉(zhuǎn)錄組信息。在這里，小編結(jié)合一篇整合單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的胃細(xì)胞圖譜研究文章，為各位讀者展現(xiàn)CosMx SMI技術(shù)的魅力。

01 研究背景

胃是重要的消化器官，具有多種生物學(xué)功能。然而，由于其細(xì)胞和腺體組成的復(fù)雜性，其精確的細(xì)胞生物學(xué)特征尚未闡明。胃粘膜腸化生是一種可直接導(dǎo)致胃癌的病理狀況，確定健康胃粘膜如何轉(zhuǎn)變?yōu)榛�生粘膜非常重要。為此，本研究利用單�?xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，和能夠獲得亞細(xì)胞水平空間轉(zhuǎn)錄組的CosMx SMI技術(shù)，構(gòu)建了迄今為止最大的成人胃細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜，首次分析了健康和化生組織中胃粘膜的整體細(xì)胞多樣性，為胃發(fā)育、干細(xì)胞生物學(xué)和癌發(fā)生等領(lǐng)域提供新的見解。

02 文章詳情

文章題目：Stomach encyclopedia: Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal cell diversity and homeostatic regulation of human stomach

中文題目：整合分析單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組揭示人胃的細(xì)胞多樣性和穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)

發(fā)表時(shí)間：2023.10

期刊名稱：Cell Reports

影響因子：8.8

實(shí)驗(yàn)平臺：10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序+CosMx SMI

DOI：10.1016/j.celrep.2023.113236

03 技術(shù)路線

為了方便各位老師快速掌握研究思路，小編繪制了文章的思路框架圖，供各位觀賞。

04 研究結(jié)果

1. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組揭示正常胃和腸化生粘膜中的細(xì)胞組成

利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲得15例患者的胃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并與已發(fā)表的17例患者胃單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合分析。這些組織均是非腫瘤胃組織，包括正常胃組織、腸化生（IM）粘膜、胃癌患者的胃炎組織及其附近的正常組織。注釋后獲得了7大類細(xì)胞類型：上皮細(xì)胞、B和漿細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞（FB）、內(nèi)皮細(xì)胞、髓系細(xì)胞和肥大細(xì)胞。接下來，研究者對其中幾種細(xì)胞類型進(jìn)行再分群，剖析其異質(zhì)性。

Fig.1 胃粘膜主要細(xì)胞類型和上皮細(xì)胞亞型

2. 上皮細(xì)胞亞群鑒定及分析

首先對上皮細(xì)胞再分群并注釋，得到小凹（F）細(xì)胞、幽門腺/頸（PG/neck）細(xì)胞、主細(xì)胞、壁細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞（NE）和增殖細(xì)胞。在嚴(yán)重IM樣本中，腸上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的數(shù)量增加，腸上皮化生的嚴(yán)重程度與REG4+ NE的頻率相關(guān)。轉(zhuǎn)錄熵分析發(fā)現(xiàn)PG/neck2干性評分更高，說明這個(gè)上皮細(xì)胞亞群中可能含有干細(xì)胞，因此以該亞群為起點(diǎn)利用monocle3算法構(gòu)建上皮細(xì)胞的發(fā)展軌跡，獲得了正常胃譜系和形態(tài)轉(zhuǎn)變譜系軌跡。此外，在PG/neck2中一小部分“連接細(xì)胞”在軌跡細(xì)胞圖上位于胃和腸道路線之間，并高表達(dá)干細(xì)胞marker基因。與其他干細(xì)胞marker相比，LEFTY1在該群中的表達(dá)更高且更特異。

在PG/neck2和ADH1+ GKN1- F細(xì)胞中，LEFTY1+比LEFTY1-干性評分更高，免疫組化染色結(jié)果顯示，LEFTY1+細(xì)胞在胃幽門和胃底腺較少，主要分布于峽部內(nèi)及其周圍。相反，在IM粘膜中這種細(xì)胞較多，主要位于隱窩底部。這些區(qū)域與干細(xì)胞區(qū)域一致，說明LEFTY1 可能是胃干細(xì)胞的新marker。LEFTY1+細(xì)胞在化生腺中最多，其次是 PG 和胃底腺。RNA原位雜交（RNA-ISH）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LEFTY1與干細(xì)胞基因共表達(dá)細(xì)胞的存在。根據(jù)軌跡分析結(jié)果，LEFTY1+細(xì)胞可以被認(rèn)為是胃和化生腺中常見的干細(xì)胞。然而，EPHB2僅在化生粘膜中的LEFTY1+細(xì)胞中表達(dá)，而在正常胃粘膜中不表達(dá)。因此，研究者提出一個(gè)假設(shè)：在腸化生過程中，正常胃腺中的LEFTY1+干細(xì)胞發(fā)生表型變化，它們通過獲得EPHB2+表型而獲得腸干細(xì)胞的獨(dú)特特性。為了解析Lefty1的功能，研究者構(gòu)建小鼠模型用于譜系示蹤實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，莫昔芬處理后第 7 天，觀察到很少的 tdTomato+ 細(xì)胞。然而，用DMP-777（可誘導(dǎo)壁細(xì)胞損傷）處理后，在胃底腺粘膜中觀察到 tdTomato+ 細(xì)胞的增殖及其在表面方向的替換，但在 PG 粘膜中未觀察到，說明Lefty1+ 細(xì)胞在胃中充當(dāng)靜止干細(xì)胞，并在急性胃粘膜損傷期間提供祖細(xì)胞。

最后，利用SCENIC算法對上皮細(xì)胞亞群的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，得到了不同亞群中轉(zhuǎn)錄因子活性的信息。胃底腺特異性細(xì)胞（主細(xì)胞和壁細(xì)胞）的SP5活性高，說明SP5對于胃底腺的發(fā)育和/或維護(hù)可能很重要。腸上皮細(xì)胞中HOXB13活性高，免疫組化證實(shí)HOXB13在化生粘膜中普遍高表達(dá)，而在正常粘膜中幾乎不表達(dá)，表明HOXB13 調(diào)控子在腸化生的發(fā)展中是不可或缺的，并且胃腺和化生腺之間的表型轉(zhuǎn)換可能需要HOXB13激活。利用GSEA分析再次說明LEFTY1+上皮細(xì)胞具有復(fù)雜且專門的代謝調(diào)節(jié)通路。

Fig.2 上皮細(xì)胞軌跡分析將LEFTY1確定為可能的新型干細(xì)胞marker

3. 成纖維細(xì)胞亞群鑒定及分析

接下來研究者對間質(zhì)細(xì)胞（包括FB、免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞）再分群和注釋，并詳細(xì)解析了FB在維持胃或胃化生上皮穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮的作用。腸化生上皮細(xì)胞和PDGFR+FB的數(shù)量呈正相關(guān)，說明二者可能存在生物學(xué)相互作用，以維持胃的腸化生分化。RNA-ISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在IM粘膜中，BMP4+FB（BMP4是PDGFR+FB的marker）更頻繁地環(huán)繞著表面區(qū)域的腸化生上皮細(xì)胞，而不是在胃粘膜中。在與腸化生相鄰的正常胃粘膜中，也能頻繁檢測到BMP4+FB。然而，在遠(yuǎn)離腸化生的正常胃粘膜中，BMP4+FB很少被發(fā)現(xiàn)，在腸化生過程中，特定FB群的組成變化比上皮細(xì)胞的變化更早發(fā)生。胃化生粘膜中FB的BMP4表達(dá)水平與正常結(jié)腸粘膜中的FB相當(dāng)，這表明BMP4相關(guān)組織穩(wěn)態(tài)的生理在化生胃腺和結(jié)直腸隱窩中是相似的。從正常胃粘膜到腸化生和結(jié)腸粘膜的BMP4陽性信號區(qū)域比例呈單調(diào)增加的趨勢，表明FB中BMP4的增加先于并且甚至可能誘導(dǎo)腸化生。SCENIC分析發(fā)現(xiàn)Forkhead Box的轉(zhuǎn)錄因子活性在PDGFR+FB和FibSmo（表達(dá)成纖維和平滑肌細(xì)胞marker）中上調(diào)，說明這兩種FB亞型對于調(diào)節(jié)胃的穩(wěn)態(tài)和腸化生轉(zhuǎn)變至關(guān)重要。

Fig.3 胃粘膜FB細(xì)胞特征

將胃FB與公共數(shù)據(jù)庫中腸道FB單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)整合分析，發(fā)現(xiàn)BARX1（有研究表明可能在正常胃發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用）在胃中特異性高表達(dá)。FibSmo表達(dá)了最高水平的BARX1和高水平的Hedgehog相互作用蛋白（HHIP），后者作為Hedgehog信號通路的調(diào)控組分，對小鼠和人正常胃的發(fā)育至關(guān)重要。RNA-ISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BARX1與HHIP的共表達(dá)。BARX1表達(dá)在幽門和胃底腺粘膜的固有層，表明BARX1通過其下游基因與上皮細(xì)胞相互作用。相反，在結(jié)腸和小腸粘膜中沒有觀察到BARX1+ FB。胃IM粘膜中存在BARX1+ FB，其比例與胃粘膜中的比例相當(dāng)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了BARX1+/HHIP+ FibSmos是一種胃特異性細(xì)胞亞群，需要進(jìn)一步的功能研究以了解其與胃的發(fā)育和腸化生的關(guān)系。有報(bào)道指出BARX1能誘導(dǎo)SFRP蛋白表達(dá)，可在發(fā)育階段阻斷WNT信號傳導(dǎo)來促進(jìn)胃上皮分化。但本研究中，胃FB中SFRP1和BARX1并不共表達(dá)，這表明成年胃與發(fā)育階段不同，BARX1不會誘導(dǎo)SFRP1的表達(dá)，SFRP對WNT的抑制不足可能是導(dǎo)致粘膜胃上皮惡性轉(zhuǎn)化失控的可能原因之一。

接下來，研究者分析FB的空間分布特征。PDGFR+ FBs和FibSmo細(xì)胞分別表達(dá)WNT5A和HHIP，RNA-ISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，WNT5A主要表達(dá)在胃和化生粘膜，主要是表面區(qū)域。WNT5A 表達(dá)水平在化生區(qū)域高于幽門或胃底粘膜，與BMP4表達(dá)一致。HHIP 在胃粘膜和化生粘膜中廣泛表達(dá)，HHIP+ FB 存在于表面及更深的區(qū)域。在整個(gè)胃粘膜中經(jīng)常觀察到緊鄰上皮細(xì)胞的 WNT5A+ FB，表明 WNT5A+ FB 可能與上皮細(xì)胞相互作用。而HHIP+ FB 分布在距上皮細(xì)胞層一定距離的間質(zhì)區(qū)域里。因此，WNT5A 似乎局部作用于鄰近的上皮細(xì)胞，而 HHIP 通過擴(kuò)散到遠(yuǎn)處的上皮細(xì)胞來更廣泛地發(fā)揮作用。

Fig.4 胃和腸FB細(xì)胞比較

4. 利用亞細(xì)胞水平空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析正常和化生胃粘膜的空間動力學(xué)

上述結(jié)果表明特定FB與上皮細(xì)胞的鄰近關(guān)系對于維持穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)腸化生的發(fā)展至關(guān)重要。因此，研究者利用CosMx SMI技術(shù)創(chuàng)建一個(gè)包含空間信息且全面的人單細(xì)胞圖譜。對一個(gè)幽門和一個(gè)胃底腺樣品進(jìn)行分析（兩者均包含IM區(qū)域），結(jié)合Cellpose神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行細(xì)胞分割，獲得了約1000個(gè)RNA靶標(biāo)的空間單細(xì)胞表達(dá)譜。與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)果相比，SMI獲得了更多的FB和上皮細(xì)胞數(shù)據(jù)，這可能是單細(xì)胞測序技術(shù)難以捕獲FB的固有困難和胃酸造成的活細(xì)胞降解。細(xì)胞注釋得到了與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組較為一致的結(jié)果。細(xì)胞鄰近度分析確認(rèn)PDGFR+ FB與上皮細(xì)胞之間鄰近度分?jǐn)?shù)更高，并且PDGFR+（BMP4+）FB更頻繁地浸潤在IM粘膜內(nèi)及其周圍。此外，本研究首次發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞與化生腸上皮細(xì)胞的鄰近度分?jǐn)?shù)比其他上皮細(xì)胞更高。NK細(xì)胞存在于正常的腸粘膜中。在腸化生中，NK細(xì)胞浸潤被認(rèn)為模仿腸粘膜的浸潤，但其詳細(xì)功能尚未闡明。

Fig.5 CosMx SMI空間轉(zhuǎn)錄組分析

接下來，研究者使用CellChat算法分析細(xì)胞的空間互作關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PDGFR+ FBs活躍地分泌多種信號分子，如非經(jīng)典WNT（ncWNT）和神經(jīng)元生長因子（NRG）信號分子，到上皮細(xì)胞。前者在胃粘膜發(fā)育中起作用，說明PDGFR+ FBs在腸化生組織穩(wěn)態(tài)和發(fā)育中起著重要作用。而NRG參與對抗凋亡和保持人滋養(yǎng)細(xì)胞分化的信號通路，NRG1能夠促使腸道干細(xì)胞增殖并在受損上皮組織中再生，表明NRG1信號可能在化生粘膜的發(fā)育和/或維持中起著重要作用。此外，當(dāng)化生上皮靠近PDGFR+ FB時(shí)，BMPs的表達(dá)會被特異性誘導(dǎo)，NRG1 和 WNT5A 在化生粘膜附近表達(dá)升高，表明化生上皮細(xì)胞和 FB 之間存在積極的相互作用。綜上所述，上皮細(xì)胞響應(yīng)外部刺激和其他因素而分泌細(xì)胞因子，誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生變化，最終導(dǎo)致永久性上皮化生變化。

Fig.6 正常和化生胃粘膜的空間動力學(xué)

05 主要結(jié)論

本研究對人胃進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，并用CosMx SMI獲得了亞細(xì)胞水平的空間轉(zhuǎn)錄組信息，從而構(gòu)建了包含空間信息的全面單細(xì)胞表達(dá)圖譜，能夠?qū)ξ讣?xì)胞和化生細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和空間信息進(jìn)行綜合分析。該分析將 LEFTY1 鑒定為未表征的干細(xì)胞marker，并通過譜系示蹤分析得到證實(shí)。上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞（包括 PDGFRA+ BMP4+ WNT5A+ 成纖維細(xì)胞）之間的相互作用在腸化生的發(fā)育轉(zhuǎn)換中起重要作用。

參考文獻(xiàn)

Tsubosaka, Ayumu et al. “Stomach encyclopedia: Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal cell diversity and homeostatic regulation of human stomach.” Cell reports vol. 42,10 (2023): 113236.