細(xì)胞外囊泡(EVs)作為潛在的治療方法、藥物輸送系統(tǒng)和疾病(如癌癥)的非侵入性診斷被廣泛研究。探討多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)儀器在卵巢癌早期檢測(cè)中的應(yīng)用：將腫瘤ev (SKOV-3)負(fù)載到表面固定化的LXY30肽上，基于MP-SPR測(cè)量，確定了相互作用的親和常數(shù)、動(dòng)力學(xué)常數(shù)、束縛質(zhì)量和層厚。LXY30肽對(duì)表達(dá)α3β1整合素的ev具有高親和力，為其診斷應(yīng)用提供了可能。
 

簡(jiǎn)介

       細(xì)胞外囊泡(EVs)是由人體細(xì)胞釋放到體液中的納米級(jí)膜囊泡。眾所周知，它們?cè)谙蛑車��?xì)胞傳遞信號(hào)和促進(jìn)細(xì)胞間甚至與遠(yuǎn)處細(xì)胞的通信方面發(fā)揮著重要作用。ev反映了親本細(xì)胞的組成和狀態(tài)，因此可以潛在地用作多種疾病(如癌癥)的標(biāo)志物。ev的膜特征可以通過整合素(跨膜糖蛋白)來表示，它影響細(xì)胞粘附、炎癥、血栓形成和轉(zhuǎn)移。特異性整合素在某些腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，產(chǎn)生特征組合，因此是癌癥診斷(檢測(cè))和治療應(yīng)用(即阻斷整合素以減少轉(zhuǎn)移)的有趣靶點(diǎn)。卵巢腫瘤細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外囊泡表達(dá)α3β1整合素。這種特殊的整合素可以被一種環(huán)狀非肽LXY30靶向，LXY30已被開發(fā)用于檢測(cè)ev。

       通常，電動(dòng)汽車的特點(diǎn)是各種技術(shù)需要標(biāo)簽和使用端點(diǎn)分析方法，而這些方法不能提供實(shí)時(shí)信息。然而，引入標(biāo)簽可能會(huì)改變顆粒的生化結(jié)構(gòu)，從而影響結(jié)果。MP-SPR是一種實(shí)時(shí)、無(wú)標(biāo)簽、靈敏度極高的方法，可測(cè)量動(dòng)態(tài)流動(dòng)條件下的物理化學(xué)現(xiàn)象。因此，它可以被認(rèn)為是表征細(xì)胞外囊泡相互作用的一種極好的方法。

       經(jīng)過驗(yàn)證的表面等離子體共振(SPR)檢測(cè)方法廣泛應(yīng)用于不同的生物傳感器研究，如評(píng)估分子相互作用的親和力和動(dòng)力學(xué)以及生物分子濃度的測(cè)定。多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)是研究多種靶標(biāo)的良好平臺(tái)。MP-SPR獨(dú)特的光學(xué)配置使分析從小分子和抗體到納米顆粒，甚至整個(gè)活細(xì)胞。特殊光學(xué)與強(qiáng)大的流體設(shè)置相結(jié)合，使MP-SPR不僅可以評(píng)估純化樣品，還可以評(píng)估粗樣品，如牛奶，海水，血漿，血清和唾液。這些特點(diǎn)與生物傳感器的發(fā)展密切相關(guān)，可用于生命科學(xué)領(lǐng)域的研究。

       特別的是，MP-SPR不僅提供了相互作用的親和力和動(dòng)力學(xué)，還提供了同一實(shí)驗(yàn)中有關(guān)層性質(zhì)和吸附質(zhì)量的信息。由于測(cè)量是在一個(gè)非常寬的角度范圍(40-78度)和在一個(gè)以上波長(zhǎng)的光，厚度和折射率沉積層可以評(píng)估。
 

材料和方法

       在MP-SPR實(shí)驗(yàn)之前，BioNavis標(biāo)準(zhǔn)金傳感器載玻片被非原位涂覆一層自組裝的生物素化烷烴硫醇(11-巰基-1-十一醇，MuOH)單層(SAM)。進(jìn)入儀器后，在運(yùn)行緩沖液TRIS-EDTA (25 mM TRIS, 1mM EDTA, pH 8.0)中設(shè)置基線信號(hào)，然后在兩個(gè)通道中注射鏈霉親和素。生物素化LXY30肽僅在一個(gè)通道中引入，留下第二個(gè)通道作為參考，不含肽。從最低濃度到最高濃度(3.4 × 109、5.7 × 109和1.7× 1010顆粒/ml)順序注射，將卵巢癌細(xì)胞外囊泡SKOV-3加載到兩個(gè)通道中。使用TraceDrawer™for MP-SPR Navi™和MP-SPR Navi™LayerSolver對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。
 

結(jié)果和討論

      成功地從癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中提取了細(xì)胞外囊泡，并對(duì)其進(jìn)行了表征，以確認(rèn)分離過程的成功。通過納米顆粒跟蹤分析(NTA)，細(xì)胞外囊泡的濃度為1.70±0.11 × 10¹³個(gè)/ml，大小分布為177±87 nm。

      通過MP-SPR確定表面結(jié)合肽(LXY30)與流動(dòng)的細(xì)胞外囊泡(SKOV-3)的相互作用(圖1)。使用TraceDrawer™軟件的“兩位點(diǎn)”結(jié)合模型分析相互作用，將其解釋為兩組肽分子與一個(gè)細(xì)胞外囊泡結(jié)合。本文對(duì)三種假設(shè)的電動(dòng)汽車進(jìn)行了評(píng)估，其中表面α3β1整合素的含量被評(píng)估為每顆�？偟鞍椎�1%，5%或10%。所有三個(gè)病例的親和力表明SKOV-3顆粒與表面結(jié)合的LXY30配體的強(qiáng)結(jié)合(圖2，表1)。在本研究中，僅測(cè)量了三種濃度的分析物，然而，通常建議測(cè)量五種或更多濃度來評(píng)估親和力和動(dòng)力學(xué)。
 

圖1：細(xì)胞外囊泡與非肽的結(jié)合用于卵巢癌的早期檢測(cè)。

圖2：使用TraceDrawer™對(duì)MP-SPR Navi™測(cè)定肽-細(xì)胞外囊泡相互作用的親和力和動(dòng)力學(xué)常數(shù)。黑色實(shí)線表示測(cè)量數(shù)據(jù)，橙色虛線表示連續(xù)注射α3β1整合素覆蓋率分別為A) 1%， B) 5%和C) 10%的三種不同種群的電動(dòng)汽車的傳感圖擬合。

表1：SKOV-3顆粒與LXY30肽結(jié)合的親和力和動(dòng)力學(xué)常數(shù)。
 

       通過在LayerSolver™軟件中擬合完整的SPR曲線來評(píng)估吸附EV層的厚度和折射率(RI)(圖3)。分析基于670和758 nm激光源提供的MP-SPR的多波長(zhǎng)測(cè)量。表面結(jié)合的電動(dòng)汽車的表面質(zhì)量密度估計(jì)為90 ng/cm2。EV層的折射率為1.341，略高于PBS等緩沖水溶液的折射率。基于MP-SPR計(jì)算的外泌體層厚度僅為34 nm，而基于NTA的平均粒徑為177±87 nm。這可能是因?yàn)镸P-SPR提供了測(cè)量區(qū)域的平均厚度，而電動(dòng)汽車在傳感器上的分布不均勻。較低的厚度值很可能是由于結(jié)合在表面的外泌體之間的空隙造成的。此外，由于結(jié)合引起的ev形狀變形可能解釋了觀測(cè)到的較低的厚度值。
 

圖3：利用LayerSolver軟件分析SKOV-3細(xì)胞外囊泡吸附前后的全MP-SPR曲線，求解顆粒層厚度和折射率。進(jìn)行了多波長(zhǎng)分析，但為了表達(dá)清晰，這里只給出了670 nm的測(cè)量曲線。

結(jié)論

      MP-SPR已被證明是表征細(xì)胞外囊泡相互作用的良好平臺(tái)，如本例所示。單個(gè)MP-SPR測(cè)量提供了幾個(gè)數(shù)值，如親和和動(dòng)力學(xué)常數(shù)、厚度、折射率和吸附質(zhì)量，而實(shí)驗(yàn)是在無(wú)標(biāo)記的方式下進(jìn)行的。這里提出的方法不僅限于細(xì)胞外囊泡，而且適用于其他類型的納米顆粒，包括聚合物和金屬納米顆粒。使用各種樣品、表面和基質(zhì)的可能性使MP-SPR成為生物傳感器開發(fā)和生命科學(xué)研究的杰出平臺(tái)。