椎間盤疾�。↖VDD）是最普遍的脊柱退行性疾病之一。由于長時間站立和肥胖導(dǎo)致的椎間盤（IVD）機械超負荷已被廣泛認為是 IVDD 的重要原因，而髓核（NP）承擔(dān)了 75% 的壓力。然而，機械超負荷誘導(dǎo) IVDD 的具體機制尚未完全闡明。

谷胱甘肽過氧化酶4（GPX4）是主要的脂質(zhì)過氧化物清除劑，在鐵死亡中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。據(jù)報道，由機械超負荷激活的 Piezo1 離子通道導(dǎo)致的鈣內(nèi)流增強誘導(dǎo) GPX4-調(diào)控的鐵死亡。已發(fā)現(xiàn)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（ER）的 Piezo1 的激活通過誘導(dǎo)ER的鈣離子釋放來增加細胞內(nèi)游離鈣。然而，機械超負荷是否會同時激活位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的 Piezo1 離子通道以升高 NP  細胞內(nèi)游離 Ca2+ 的水平，從而導(dǎo)致 GPX4 調(diào)控的鐵死亡仍有待確定。

硒蛋白K（SelK）是一種ER蛋白，已被證明與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細胞抗氧化性有關(guān)。硒（Selenium）是一種必需的微量營養(yǎng)素，參與了抗氧化應(yīng)激的保護。補充硒可以上調(diào)各種硒蛋白的表達，并且在濾泡輔助性T細胞中證明了 Selenium-GPX4 軸對鐵死亡的保護作用。然而，目前還沒有關(guān)于補硒是否可以通過上調(diào) NP 細胞中的 SelK 和 GPX4 來減輕鐵死亡的報道。

最近，在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院骨科、病理科及美國布萊根婦女醫(yī)院骨科的一項聯(lián)合研究中，計劃探索機械超負荷是否通過激活位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的 Piezo1 離子通道來阻礙 GPX4 的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致 NP 細胞中的鐵死亡。在上述過程中，研究員將確定促進 ER 應(yīng)激的因素以及ER應(yīng)激在鐵死亡中的具體作用，此外，將驗證補充硒是否可以通過上調(diào) GPX4 和 SelK 來減輕機械超負荷誘導(dǎo)的 NP 細胞鐵死亡。研究成果發(fā)表在 Cellular and Molecular Life Sciences 期刊題為“Selenium-SelK-GPX4 axis protects nucleus pulposus cells against mechanical overloading-induced ferroptosis and attenuates senescence of intervertebral disc”。
首先，為了研究 IVDD 期間 NP 組織中鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的變化，評估了退變椎間盤的 Pfirrmann 分級（圖1 A）。與早期階段相比，晚期退行性椎間盤的 NP 組織體積萎縮，彈性下降（圖1 B）。在退行性 NP 組織（IV級）中，GPX4 表達水平降低，但鐵死亡生物標(biāo)志物 ACSL4 的表達水平升高（圖1 B）。

為了驗證 NP 中過度機械負荷與鐵死亡之間的關(guān)系，將大鼠 NP 細胞在 1 Hz、1 MPa 機械應(yīng)力下培養(yǎng) 1 h。微陣列結(jié)果表明，與對照組相比，在機械應(yīng)力刺激下，NP 細胞中 ECM 代謝紊亂，ACSL4 水平增加（圖1 C）。GO分析顯示，差異表達蛋白與細胞鈣離子穩(wěn)態(tài)和對ER應(yīng)激的反應(yīng)高度相關(guān)，ER 成為最顯著富集的細胞成分之一（圖1 D）。對 ER 應(yīng)激生物標(biāo)志物 ATF6 進行 IHC，發(fā)現(xiàn)與 II 級相比，IV 級 NP 組織中 ATF6 顯著增加（圖1 E）。

此外，通過 TEM 研究了機械刺激對 NP 細胞的影響。與對照組相比，在機械超負荷組 ER 在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出異常腫脹，線粒體表現(xiàn)出線粒體膜增厚和線粒體萎縮等鐵死亡相關(guān)變化（圖1 G）。然后，Western blotting 和 qPCR 證實機械刺激降低了GPX4水平，增加了 ACSL4 水平和 ER 應(yīng)激標(biāo)志物 Bip 水平（圖1 H、I）。通過 GPX4 條件敲除小鼠證明了內(nèi)源性 GPX4 在 IVD 中的生理作用（圖1 J）。

這些數(shù)據(jù)表明，過度的機械負荷會誘導(dǎo) NP 細胞的鐵死亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
接下來，實驗使用 SiPiezo1 和無鈣培養(yǎng)基來研究鐵死亡、ER 應(yīng)激和機械超負荷之間的關(guān)聯(lián)（圖2 A、B）。有趣的是，清除細胞外 Ca2+ 減輕了由機械刺激誘導(dǎo)的細胞內(nèi)游離 Ca2+ 水平的升高，而 Piezo1 的敲低具有更強的作用（圖2 C）。另一方面，Calnexin 水平與細胞內(nèi)游離 Ca2+ 水平成反比，這表明過度的機械負荷通過 Piezo1 增加了細胞內(nèi)游離 Ca2+ 水平（圖2 C-F）。同樣，Piezo1 的敲低減少了由機械刺激的 Bip 的上升，這種效果比僅清除細胞外 Ca2+ 要顯著（圖2 D-F）。

機械超負荷增加了 NP 細胞中 ROS 的產(chǎn)生并損害了線粒體的膜電位，同時敲低 Piezo1 并清除了細胞外 Ca2+ 逆轉(zhuǎn)了這些變化，但前者更有效（圖2 G-J）。敲低 Piezo1 上調(diào)了機械刺激誘導(dǎo)的 Col-2 水平的下降，而清除細胞外 Ca2+ 作用較弱（圖2 D-F）。

此外，建立 Piezo1-CKO 小鼠闡明 Piezo1 在 ER 應(yīng)激中的作用。ATF6 免疫組化結(jié)果顯示，老齡 Piezo1-CKO 小鼠尾椎椎間盤 ER 應(yīng)激水平顯著低于老齡 WT 小鼠（圖2 K、K）。在 Piezo1 被 SiPiezo1 敲低后，細胞內(nèi)游離 Ca2+ 水平的升高被顯著逆轉(zhuǎn)，表明 Piezo1 的作用。

這些數(shù)據(jù)表明，機械超負荷通過位于 NP 細胞質(zhì)膜和 ER 膜上的 Piezo1 離子通道來增加細胞內(nèi)游離 Ca2+ 水平以誘導(dǎo) ER 應(yīng)激和鐵死亡。

據(jù)報道，抑制ER應(yīng)激可以減輕結(jié)腸上皮細胞的鐵死亡，研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+ 可能是 ER 應(yīng)激和鐵死亡之間的關(guān)鍵節(jié)點。因此，利用 Ca2+-free 培養(yǎng)基和 ER 應(yīng)激抑制劑 Bip 誘導(dǎo)因子X （BIX）進一步探討了 ER 應(yīng)激、鐵死亡與細胞內(nèi)游離 Ca2+ 之間的關(guān)聯(lián)。數(shù)據(jù)顯示，BIX 上調(diào)了 Bip 的水平，從而改善了 ER 應(yīng)激并進一步降低了 ER 應(yīng)激生物標(biāo)志物 PERK 的水平，且細胞內(nèi)游離 Ca2+ 的水平也降低。相應(yīng)地，觀察到 Calnexin 水平與細胞內(nèi)游離 Ca2+ 成反比，ACSL4 與之呈正比，GPX4 與之呈反比。此外，抑制ER應(yīng)激進一步降低了 ROS 合成的升高，緩解了線粒體功能障礙，減少 ECM 分解代謝生物標(biāo)志物 MMP-13 的產(chǎn)生，并促進 ECM 合成代謝生物標(biāo)志物 Col-2 的分泌。這些數(shù)據(jù)表明，抑制ER應(yīng)激通過減輕從 ER 流出的 Ca2+ 來減弱機械超負荷誘導(dǎo)的鐵死亡。 圖2    機械超負荷通過位于 NP 細胞質(zhì)膜和 ER 膜上的 Piezo1 離子通道來增加細胞內(nèi)游離 Ca2+ 水平以誘導(dǎo) ER 應(yīng)激和鐵死亡。

進一步的，實驗收集了不同等級的人類 NP 組織，并檢測了selenium 的濃度，發(fā)現(xiàn)退行性 NP 組織（IV級）中其濃度降低（圖3 A）。此外，在 500 kPa 或 1 MPa 的機械應(yīng)力下培養(yǎng)大鼠 NP 細胞，無論是否添加 Se-Met，高應(yīng)變負荷降低了 selenium 的濃度，但補充 Se-Met 逆轉(zhuǎn)了這種變化（圖3 B）。補充 Se-Met 還改善了 ECM 代謝紊亂，促進了細胞對鈣離子和 ER 應(yīng)激的反應(yīng)（圖3 C、D），并改善機械超負荷引起的 ER 腫脹和線粒體萎縮（圖3 E）。qPCR 和 Western blotting 顯示，高應(yīng)變負荷降低了 GPX4 mRNA 和蛋白水平，而補充 Se-Met 促進了 GPX4 的表達（圖3 F、G）。Se-Met 還改善了機械超負荷誘導(dǎo)的 ROS 合成升高和線粒體功能障礙，并促進 Col-2 的表達，但當(dāng)額外應(yīng)用 GPX4 抑制劑 ML210 時，無法再觀察到這種現(xiàn)象（圖3 H、I、J）。Se-Met 還可減少 ADAMTS-5 和 MMP-13 的產(chǎn)生，促進 Aggrecan 和 Col-2 的分泌，而 ML210 則加重了 ECM 代謝紊亂（圖3 K-M）。這些數(shù)據(jù)表明，補充 Selenium 通過增強 GPX4 表達來保護 NP 細胞免受鐵死亡的影響。

為了探索 SelK 在機械超負荷誘導(dǎo)的 ER 應(yīng)激中的作用，在大鼠 NP 細胞中敲低 SelK，添加 Se-Met，并對 NP 細胞進行機械超負荷刺激。qPCR 和 Western blotting 顯示，補充 Se-Met 組的 SelK 表達上調(diào)，ATF6 和 PERK 降低，而補充 Se-Met 的 SelK 敲低組則沒有出現(xiàn)這些結(jié)果。Se-Met 組的 GPX4 表達最高，ROS 合成減少，線粒體功能障礙得到改善，而 SelK 敲低后效果消失。此外，補充 Se-Met 可減少 ADAMTS-5 和 MMP-13 的產(chǎn)生，促進 Aggrecan 和 Col-2 的分泌，而敲低 SelK 會加重 ECM 代謝紊亂。這些數(shù)據(jù)表明，補充 Selenium 通過上調(diào) SELK 表達來減輕 ER 應(yīng)激。
最后，使用 WT 和 GPX4-CKO 小鼠來驗證 Selenium 在體內(nèi)的作用，在12周齡的 WT 和 GPX4-CKO 小鼠中建立 IVDD 模型（圖4 A、B），收集小鼠的尾骨椎間盤組織，檢測  Selenium 的濃度。有趣的是，針刺降低了 Selenium 的濃度，但補充 Se-Met 改善了這種變化，但這種效果在 GPX4-CKO 小鼠中減弱（圖4 C）。MRI和顯微CT顯示，Se-Met 可緩解 WT 小鼠針刺誘導(dǎo)的 IVDD，然而，通過補充 Selenium，GPX4-CKO 小鼠的 IVDD 表型并未得到改善（圖4 D、E）。免疫組化染色顯示，補充 Se-Met 的 WT 和 GPX4-CKO 小鼠中 SelK 表達增加，ATF6 降低（圖4 F、G）。此外，在補充 Se-Met 的 WT 小鼠中觀察到 Col-2 的表達增加和 MMP-13 的表達降低，但在 GPX4-CKO 小鼠中沒有觀察到（圖4 F、G），這提示 GPX4 是 Se-Met 起作用的關(guān)鍵節(jié)點。這些數(shù)據(jù)表明，補充 Selenium 可緩解小鼠 IVDD 的進展。
綜上所述，該研究表明，在 NP 細胞中，當(dāng)位于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的 Piezo1 離子通道被機械超負荷激活時，細胞外鈣內(nèi)流和細胞內(nèi)鈣外流加強，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載，從而導(dǎo)致 ER 應(yīng)激，進一步加劇 ER 鈣外流，進而阻礙 GPX4 的產(chǎn)生和功能，誘導(dǎo)鐵死亡和 ECM 代謝紊亂。然而，補充 Selenium 可以上調(diào) SelK 表達，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，增強 GPX4 表達，減弱細胞氧化應(yīng)激和鐵死亡�？傊�，鐵死亡在機械超負荷誘導(dǎo)的 IVDD 中起重要作用，補充 Selenium 對減輕鐵死亡，從而緩解 IVDD 具有重要意義，這可能為 IVDD 的潛在治療干預(yù)提供見解。

參考文獻：Jia C, Xiang Z, Zhang P, Liu L, Zhu X, Yu R, Liu Z, Wang S, Liu K, Wang Z, Vasilev K, Zhou S, Geng Z, Liu X, Zhao Y, Gao Y, Cheng L, Li Y. Selenium-SelK-GPX4 axis protects nucleus pulposus cells against mechanical overloading-induced ferroptosis and attenuates senescence of intervertebral disc. Cell Mol Life Sci. 2024 Jan 22;81(1)49. doi 10.1007s00018-023-05067-1. PMID 38252317; PMCID PMC10803455.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38252317
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