實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴增反應(yīng)中,以熒光化學物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。
在常做的QPCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
在Real-timePCR中,模板定量有兩種策略,相對定量和絕對定量。
相對定量是用于測定兩個或多個不同樣品中靶基因量的差異,得到的數(shù)據(jù)是目的基因在各樣本中含量的相對比例。即將實驗樣本中靶基因的Ct值與對照樣本的Ct值進行比較,結(jié)果用實驗樣本中靶基因量與對照樣本中靶基因量的比值或差異倍數(shù)來表示。該方法在qPCR定量檢測RNA水平中最常見,研究生理變化對基因表達水平的影響。
絕對定量常用于精確計算初始模板中目的基因的濃度,比如測定血液樣品中病毒顆粒數(shù)(DNA或RNA),細胞中基因的拷貝數(shù)等,得到的數(shù)據(jù)是單個樣本的定量描述,不依賴于其他樣本。理想情況下,Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,這種關(guān)系表現(xiàn)為標準曲線,絕對定量的檢測即根據(jù)標準曲線對未知樣品進行的定量。
一、實驗方法
1.RNA提取
(1)目前最常用的RNA提取方法就是trizol法,具有極強的裂解能力,可以在短時間內(nèi)充分裂解細胞或者組織樣本,保持RNA的完整性,有效抑制RNA的降解;目前市面上還有很多成品的常用RNA提取試劑盒,均是如此原理。
2.具體步驟
(1)拿出凍存組織或者新鮮組織,稱重,充分液氮研磨;
(2)加入1ml trizol或者其他成品裂解液,充分混勻后放置震蕩搖勻上5-10min,使樣本充分裂解;
(3)4℃,13000rpm離心5min后,吸取上清轉(zhuǎn)移至新1.5ml離心管中;
(4)加入預(yù)冷氯仿后,迅速劇烈震蕩30s-60s,靜置5-10min后,4℃離心;
(5)此時離心管中液體分為三層,吸取最上層水溶液轉(zhuǎn)移新離心管中;
(6)加入等體積異丙醇,充分混勻后,靜置5-10min后,4℃離心;
(7)棄上清,對管底白色沉淀加入預(yù)冷75%乙醇,混勻清洗后,4℃離心,棄上清;
(8)吹干沉淀后,加入DEPC水溶液,測濃度,-80攝氏度保存。
3.RNA濃度測量
一般使用nanodrop就可以測量,觀察260/280在1.8-2即可;此外也可以進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,若出現(xiàn)明顯拖帶RNA可能降解;
4.反轉(zhuǎn)錄
(1)RNA自身是無法作為PCR反應(yīng)的模板的,需要先將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,在進行QPCR檢測;
(2)通常根據(jù)RNA濃度,每個樣本量取固定3ug/5ug的RNA進行反轉(zhuǎn)錄,加入反轉(zhuǎn)錄試劑盒中配套的試劑,在固定溫度進行;得到的cDNA稀釋同倍數(shù)后,-80℃保存。
5.實時熒光定量PCR檢測
(1)常規(guī)認為相同RNA的量進行的反轉(zhuǎn)錄,得到的cDNA不需要調(diào)整濃度,在上機檢測PCR時取相同體積cDNA進行,一般取2-4ul均可。
(2)如果是做絕對定量,則上述需要增加標準品即可;如果是做常規(guī)mRNA,內(nèi)參插管選擇actin或者GAPDH即可;若檢測的是特殊的micRNA等,內(nèi)參常規(guī)使用U6。
(3)常見案例