Western Blotting（WB）蛋白質(zhì)免疫印跡雜交，是采用印跡技術(shù)將聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，再根據(jù)抗原-抗體特異性反應，即一抗/二抗復合物特異性檢測復雜樣品中某種蛋白的方法（流程如圖1）。WB是最常用的蛋白質(zhì)分析技術(shù)之一，廣泛應用于蛋白表達水平的檢測。

圖1：Western blotting實驗流程
 

WB實驗過程長，步驟多，結(jié)果嚴重依賴操作者的經(jīng)驗積累和細節(jié)把控。為了獲得穩(wěn)定、可靠和可重復的結(jié)果，必須優(yōu)化WB流程的所有步驟。美國Precision Biosystems推出的全自動蛋白質(zhì)免疫印跡雜交系統(tǒng)Blotcycler，將傳統(tǒng)的手工過程自動化處理，極大降低了人為因素的干擾，提高了結(jié)果的重復性。在諸多環(huán)節(jié)中，溫度選擇同樣重要。一抗孵育條件有4℃過夜，室溫或37℃下1-2小時（h）幾種，其中4℃過夜效果最佳。因此在手工操作流程中，考慮到實際操作的便利和可行性，實驗者會采用全程室溫，或者一抗4℃過夜孵育其余封閉、二抗孵育和洗膜均在室溫下進行。通過對比實驗發(fā)現(xiàn)，與全程室溫或只有一抗4℃孵育相比，多數(shù)情況下全程（包括封閉，一抗孵育，二抗孵育和洗膜）4℃，可獲取到更好的結(jié)果。

洗膜過程在4℃下進行，可以避免特異性抗體-抗原結(jié)合的過度解離，同時有效減少非特異性結(jié)合，提高結(jié)果質(zhì)量。實驗者采用透明細胞腎癌（ccRCC）細胞系的細胞提取物與兔多克隆抗PARP抗體進行WB實驗。在完全一致的電泳轉(zhuǎn)膜后，將a膜進行手工封閉孵育和洗膜操作，一抗4℃下過夜孵育，其余步驟均在室溫下完成，b膜采用Blotcycler全程4℃下自動化處理，其結(jié)果如圖2所示：采用手工程序處理的印跡膜，結(jié)果檢測到多個非特異性條帶，見圖2a；而Blotcycler全程4℃下自動化處理的印跡膜，僅檢測到未切割的PARP蛋白（113kD）以及C端和N端切割的PARP片段（分別為89kD和24kD）的條帶，見圖2b（數(shù)據(jù)來自Precision Biosystems）。

圖2: a，所有步驟（封閉，孵育，洗膜）均手工操作，一抗孵育4度過夜，其余步驟均室溫；b，所有步驟（封閉，孵育，洗膜）均在4度，Blotcycler自動化處理
 

另外，全程4℃下進行，可以有效提高信噪比和相對靈敏度。實驗者采用HeLa細胞的全細胞裂解液和h-IL2進行多重熒光WB平行對比，在完全一致的電泳轉(zhuǎn)膜后，將a、b兩張膜分別在室溫和4℃下Blotcycler自動化處理。其結(jié)果如圖3，對兩張膜進行熒光強度歸一化處理后發(fā)現(xiàn)，全程4℃處理的b膜具有更高的信噪比和更好的相對靈敏度，如圖3c（數(shù)據(jù)來自Rockland Immunochemicals, Inc）。

圖3: a，所有步驟（封閉，孵育，洗膜）均在室溫下進行；b，所有步驟（封閉，孵育，洗膜）均在4度下進行；a和b中，泳道1為marker，泳道2為HeLa細胞的全細胞裂解液，泳道3為重組h-IL2，泳道4為HeLa細胞全細胞裂解液和重組h-IL2的混合樣本；c，用MW標準對兩張膜進行熒光強度歸一化處理后的結(jié)果；
 

從以上數(shù)據(jù)可以看出，Blotcycler全自動蛋白質(zhì)免疫印跡雜交系統(tǒng)不僅能避免人為誤差，提高結(jié)果的重復性，也可以通過優(yōu)化封閉、洗膜的溫度條件，消除非特異條帶，提高相對靈敏度，產(chǎn)出高質(zhì)量的結(jié)果

來自美國Precision Biosystems公司的Blotcycler，是一款全自動的蛋白質(zhì)印跡雜交系統(tǒng)，Western Blot洗液工作站，可整機置于4度環(huán)境，自動化完成封閉、孵育、清洗和一抗回收的一系列工作，徹底解放您的雙手。專利的流體清洗減少二抗在膜上的附著，降低背景，提高信噪比和靈敏度；自動化的操作流程避免了手工操作帶來的誤差，保證了批次內(nèi)和批次間實驗的高度重復性；高通量操作和多條件的設(shè)定可以輔助您優(yōu)化Western Blot 實驗的條件；開放的實驗平臺，無需其他額外投入。Blotcycler是從事Western Blot實驗的科研工作者最佳選擇。

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