Western Blotting（WB）蛋白質(zhì)免疫印跡雜交，是采用印跡技術(shù)將聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，再根據(jù)抗原-抗體特異性反應(yīng)，即一抗/二抗復(fù)合物特異性檢測(cè)復(fù)雜樣品中某種蛋白的方法（流程如圖1）。WB是最常用的蛋白質(zhì)分析技術(shù)之一，廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。

圖1：Western blotting實(shí)驗(yàn)流程
 

WB實(shí)驗(yàn)過(guò)程長(zhǎng)，步驟多，結(jié)果嚴(yán)重依賴操作者的經(jīng)驗(yàn)積累和細(xì)節(jié)把控。為了獲得穩(wěn)定、可靠和可重復(fù)的結(jié)果，必須優(yōu)化WB流程的所有步驟。美國(guó)Precision Biosystems推出的全自動(dòng)蛋白質(zhì)免疫印跡雜交系統(tǒng)Blotcycler，將傳統(tǒng)的手工過(guò)程自動(dòng)化處理，極大降低了人為因素的干擾，提高了結(jié)果的重復(fù)性。在諸多環(huán)節(jié)中，溫度選擇同樣重要。一抗孵育條件有4℃過(guò)夜，室溫或37℃下1-2小時(shí)（h）幾種，其中4℃過(guò)夜效果最佳。因此在手工操作流程中，考慮到實(shí)際操作的便利和可行性，實(shí)驗(yàn)者會(huì)采用全程室溫，或者一抗4℃過(guò)夜孵育其余封閉、二抗孵育和洗膜均在室溫下進(jìn)行。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與全程室溫或只有一抗4℃孵育相比，多數(shù)情況下全程（包括封閉，一抗孵育，二抗孵育和洗膜）4℃，可獲取到更好的結(jié)果。

洗膜過(guò)程在4℃下進(jìn)行，可以避免特異性抗體-抗原結(jié)合的過(guò)度解離，同時(shí)有效減少非特異性結(jié)合，提高結(jié)果質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)者采用透明細(xì)胞腎癌（ccRCC）細(xì)胞系的細(xì)胞提取物與兔多克隆抗PARP抗體進(jìn)行WB實(shí)驗(yàn)。在完全一致的電泳轉(zhuǎn)膜后，將a膜進(jìn)行手工封閉孵育和洗膜操作，一抗4℃下過(guò)夜孵育，其余步驟均在室溫下完成，b膜采用Blotcycler全程4℃下自動(dòng)化處理，其結(jié)果如圖2所示：采用手工程序處理的印跡膜，結(jié)果檢測(cè)到多個(gè)非特異性條帶，見圖2a；而Blotcycler全程4℃下自動(dòng)化處理的印跡膜，僅檢測(cè)到未切割的PARP蛋白（113kD）以及C端和N端切割的PARP片段（分別為89kD和24kD）的條帶，見圖2b（數(shù)據(jù)來(lái)自Precision Biosystems）。

圖2: a，所有步驟（封閉，孵育，洗膜）均手工操作，一抗孵育4度過(guò)夜，其余步驟均室溫；b，所有步驟（封閉，孵育，洗膜）均在4度，Blotcycler自動(dòng)化處理
 

另外，全程4℃下進(jìn)行，可以有效提高信噪比和相對(duì)靈敏度。實(shí)驗(yàn)者采用HeLa細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液和h-IL2進(jìn)行多重?zé)晒釽B平行對(duì)比，在完全一致的電泳轉(zhuǎn)膜后，將a、b兩張膜分別在室溫和4℃下Blotcycler自動(dòng)化處理。其結(jié)果如圖3，對(duì)兩張膜進(jìn)行熒光強(qiáng)度歸一化處理后發(fā)現(xiàn)，全程4℃處理的b膜具有更高的信噪比和更好的相對(duì)靈敏度，如圖3c（數(shù)據(jù)來(lái)自Rockland Immunochemicals, Inc）。

圖3: a，所有步驟（封閉，孵育，洗膜）均在室溫下進(jìn)行；b，所有步驟（封閉，孵育，洗膜）均在4度下進(jìn)行；a和b中，泳道1為marker，泳道2為HeLa細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液，泳道3為重組h-IL2，泳道4為HeLa細(xì)胞全細(xì)胞裂解液和重組h-IL2的混合樣本；c，用MW標(biāo)準(zhǔn)對(duì)兩張膜進(jìn)行熒光強(qiáng)度歸一化處理后的結(jié)果；
 

從以上數(shù)據(jù)可以看出，Blotcycler全自動(dòng)蛋白質(zhì)免疫印跡雜交系統(tǒng)不僅能避免人為誤差，提高結(jié)果的重復(fù)性，也可以通過(guò)優(yōu)化封閉、洗膜的溫度條件，消除非特異條帶，提高相對(duì)靈敏度，產(chǎn)出高質(zhì)量的結(jié)果

來(lái)自美國(guó)Precision Biosystems公司的Blotcycler，是一款全自動(dòng)的蛋白質(zhì)印跡雜交系統(tǒng)，Western Blot洗液工作站，可整機(jī)置于4度環(huán)境，自動(dòng)化完成封閉、孵育、清洗和一抗回收的一系列工作，徹底解放您的雙手。專利的流體清洗減少二抗在膜上的附著，降低背景，提高信噪比和靈敏度；自動(dòng)化的操作流程避免了手工操作帶來(lái)的誤差，保證了批次內(nèi)和批次間實(shí)驗(yàn)的高度重復(fù)性；高通量操作和多條件的設(shè)定可以輔助您優(yōu)化Western Blot 實(shí)驗(yàn)的條件；開放的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，無(wú)需其他額外投入。Blotcycler是從事Western Blot實(shí)驗(yàn)的科研工作者最佳選擇。

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