前 言

獲批IND的候選藥物在臨床前動(dòng)物模型上表現(xiàn)出很好的藥效結(jié)果和安全性，但在人體的有效性和安全率卻不到10%。導(dǎo)致該結(jié)果的原因包括：種屬之間的差異、動(dòng)物模型選擇的準(zhǔn)確性、動(dòng)物藥效實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性、客觀性和準(zhǔn)確性等。

相較于細(xì)胞系（celllines）、基因工程鼠（genetically engineered mouse models, GEMMs）和人源化異種移植鼠（patient-derived xenografts, PDX）這些傳統(tǒng)的研究模型，類器官模型（鼠源類器官mouse-derived organoids, MDO）和人源類器官patient-derived organoids,PDO）不但能夠取自正常組織和組織癌變過程中各個(gè)階段的腫瘤組織，而且其培養(yǎng)體系簡(jiǎn)單易操作，時(shí)間和金錢成本較低，且具有較高效率，因而得到廣大研究人員的青睞，被Nature Methods評(píng)為2017年生命科學(xué)領(lǐng)域年度技術(shù)。

01

類器官研究領(lǐng)域

自2009年Hans Clevers教授報(bào)道了第一例類器官，共有11983篇關(guān)于類器官的研究論文發(fā)表（數(shù)據(jù)來源于PubMed），研究領(lǐng)域主要涉及腫瘤學(xué)和生物學(xué)，近4年來（2018-2022年），共發(fā)表10441篇論文發(fā)表，占整體發(fā)文量的87.1%。作為類器官領(lǐng)域的“獨(dú)角獸”Hans Clevers，共有263篇論文發(fā)表，部分論文發(fā)表在Nature、Cell等期刊。

02

類器官簡(jiǎn)介

類器官（organoid）：體外三維（3D）培養(yǎng)成體干細(xì)胞或多能干細(xì)胞的技術(shù)被稱之為“類器官”（Organoids）技術(shù)，所培養(yǎng)的組織類似物具有一定空間結(jié)構(gòu)，并能模擬真實(shí)器官部分功能。主要來源于胚胎干細(xì)胞、多功能誘導(dǎo)干細(xì)胞、成體干細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞。

03

類器官培養(yǎng)及構(gòu)建

類器官培養(yǎng)方式主要分為2類：浸潤(rùn)式培養(yǎng)和氣液交界培養(yǎng)。

類器官的構(gòu)建就像是在調(diào)制一杯“雞尾酒”。其主要原理是基于干細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)原理，根據(jù)胚胎發(fā)育和器官發(fā)生線索，模擬自然發(fā)育過程而分化形成特定譜系的微小器官。與傳統(tǒng)模型相比：最大程度模擬體內(nèi)相應(yīng)組織器官的空間結(jié)構(gòu)和生理功能，而提供與人體高度一致的生理/病理系統(tǒng)。

以小腸類器官為例，2007年，Hans Clevers實(shí)驗(yàn)室就通過lineage tracing實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)）發(fā)現(xiàn)小腸和結(jié)腸的干細(xì)胞為L(zhǎng)gr5+細(xì)胞。2009年，荷蘭科學(xué)家Hans Clevers的團(tuán)隊(duì)成功地在體外將Lgr5+腸道干細(xì)胞培養(yǎng)成包括隱窩樣區(qū)域和絨毛樣上皮區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)，即小腸類器官。這一結(jié)構(gòu)包含所有終末分化細(xì)胞類型，能準(zhǔn)確模擬腸道上皮生理情況，這一方法的建立既實(shí)現(xiàn)了腸上皮長(zhǎng)期體外培養(yǎng)又可以維持腸上皮細(xì)胞原始分化能力，該技術(shù)已經(jīng)逐漸被應(yīng)用于干細(xì)胞、疾病模型以及再生藥物等相關(guān)研究。小腸類器官的培養(yǎng)可以通過多能誘導(dǎo)干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞來誘導(dǎo)分化，也可以取小腸的隱窩干細(xì)胞來誘導(dǎo)分化。目前大多數(shù)研究都是采用小腸隱窩干細(xì)胞來培養(yǎng)，因?yàn)樵摲椒ú粌H獲取干細(xì)胞方便，對(duì)技術(shù)的要求不高，而且培養(yǎng)的類器官傳代次數(shù)更多，可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月之久。具體培養(yǎng)方式見ppt原文。

04

類器官種類

類器官培養(yǎng)已應(yīng)用于各種器官，包括：大腦（brain）、視杯（Optic Cup）、內(nèi)耳（Inner Ear）、肺(lung)、肝(liver)、結(jié)腸（Colon）、腎（Kidney）、胰腺(Pancreatic)、前列腺(Prostate)、胃（Gastroids）、乳腺（galactophore），2023年1月，Hans Clevers團(tuán)隊(duì)構(gòu)建出非酒精性脂肪肝類器官模型，工程人肝細(xì)胞類器官使基于CRISPR的靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和藥物篩選成為可能。

05

類器官應(yīng)用

類器官應(yīng)用領(lǐng)域廣闊：類器官作為體外模型，在疾病發(fā)生機(jī)理、新靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、診療新策略探索、藥敏檢測(cè)、新藥研發(fā)、再生醫(yī)學(xué)等多方向擁有廣泛的應(yīng)用前景。其中肝類器官已被應(yīng)用于藥物療效毒性以及輔助患者建立個(gè)體化治療方案等。我們以“利用肝臟類器官預(yù)測(cè)藥物誘導(dǎo)的磷脂質(zhì)病”為例，介紹類器官的應(yīng)用。

PL誘導(dǎo)劑：阿米卡星、鹽酸胺碘酮、鹽酸舍曲林和對(duì)乙酰氨基酚。阿米卡星、胺碘酮和舍曲林分別是弱、中度和強(qiáng)的PL誘導(dǎo)藥物。對(duì)乙酰氨基酚作為誘導(dǎo)PL的陰性對(duì)照藥物。

類器官培養(yǎng)：單個(gè)患者的人肝組織（0.5-1cm3）從首爾峨山醫(yī)療中心進(jìn)行的肝切除術(shù)中獲得。手術(shù)切除后，組織在漢克斯平衡鹽溶液（HBSS）中保持在4℃，直到處理。參考前期文獻(xiàn)：組織用無菌剪刀切碎，用膠原酶D和Dnase I在無菌Earle平衡鹽溶液（EBSS）培養(yǎng)基中中消化。將分離的導(dǎo)管細(xì)胞與基質(zhì)凝膠或還原生長(zhǎng)因子BME 2（基底膜提取物）混合，每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中。基質(zhì)凝膠或BME固化后，每孔加入500µL培養(yǎng)基�；�礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM/F12，并包括各種補(bǔ)充劑。前3天，培養(yǎng)基中添加25 ng/mL重組人肝素、100 ng/mL Wnt3a和10µM Y27632分離導(dǎo)管細(xì)胞。然后用不含Noggin、Wnt3a或Y27632代替。在單個(gè)導(dǎo)管細(xì)胞變成一個(gè)類器官后，每5-7天以1：2-1：4的分裂比例進(jìn)行傳代。在37℃的含有5%二氧化碳的潮濕氣氛中培養(yǎng)。

肝標(biāo)志物表達(dá)：類器官與HepG2表達(dá)水平相當(dāng)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)CYP3A4和白蛋白基因的表達(dá)情況。從人肝組織中提取的RNA作為陽性對(duì)照。CYP3A4在類器官細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平略高于HepG2細(xì)胞（圖a）。類器官細(xì)胞和HepG2細(xì)胞之間的白蛋白mRNA表達(dá)水平相當(dāng)（圖b）。肝組織中CYP3A4和白蛋白的mRNA表達(dá)水平明顯高于類器官和HepG2培養(yǎng)系統(tǒng)。

糖原積累：采用PAS染色法檢測(cè)人肝類器官、HepG2細(xì)胞和人肝組織中糖原的積累情況。類器官呈明顯的陽性糖原染色，呈強(qiáng)烈的洋紅色。HepG2細(xì)胞的染色不如類器官細(xì)胞清晰。類器官細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有多糖或糖原、糖蛋白、糖脂等多糖或粘液物質(zhì)，如圖所示。

蛋白表達(dá)：肝臟轉(zhuǎn)錄因子HNF4α在類器官中表達(dá)比HepG2強(qiáng)很多。用免疫熒光法在兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中均可檢測(cè)到肝蛋白HNF4α。如圖a-c所示，人肝類器官蛋白呈陽性（綠色），強(qiáng)于HepG2細(xì)胞。在HepG2細(xì)胞的胞漿中呈非特異性陽性染色。通過免疫組化方法觀察了兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中CYP3A4和CYP1A2的表達(dá)。如圖d-f所示，CYP3A4在人肝類器官中的表達(dá)比在HepG2細(xì)胞中更明顯。CYP1A2在兩種肝細(xì)胞培養(yǎng)中均明顯表達(dá)陽性（圖g-i）。

細(xì)胞活力測(cè)試：在培養(yǎng)48小時(shí)后，當(dāng)暴露于高劑量的PL誘導(dǎo)藥物時(shí)，人肝臟類器官比HepG2細(xì)胞存活得更好。各PL藥物組的類器官和HepG2細(xì)胞的活力均發(fā)生了顯著變化。2D和3D培養(yǎng)的肝細(xì)胞均暴露于舍曲林。在20µM劑量的胺碘酮和舍曲林作用下，HepG2細(xì)胞的單層細(xì)胞顯示出明顯的細(xì)胞死亡，而在這些藥物濃度下，類器官的活性更高。對(duì)乙酰氨基酚在25µM或50µM水平下使用，在兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中均未引起顯著的細(xì)胞活力變化。

白蛋白分泌水平：在PL誘導(dǎo)藥物存在的情況下，HepG2細(xì)胞的白蛋白分泌水平比肝類器官更明顯地下降（取決于其PL誘導(dǎo)潛能的強(qiáng)度）。兩種肝細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)均與10µM PL誘導(dǎo)藥物或25µM對(duì)乙酰氨基酚作為陰性對(duì)照孵育48 h。與HepG2細(xì)胞相比，類器官細(xì)胞保持了更穩(wěn)定的白蛋白分泌能力。

形態(tài)學(xué)變化：為了評(píng)估PL導(dǎo)致的類器官和HepG2細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞用10µM的指示藥物或25µM的對(duì)乙酰氨基酚處理48小時(shí)，H&E染色。如圖所示，在兩種培養(yǎng)系統(tǒng)中，具有較高的PL誘導(dǎo)能力的藥物均可導(dǎo)致較高的細(xì)胞質(zhì)液泡量。雖然這些液泡變化認(rèn)為是藥物誘導(dǎo)的PL的結(jié)果，但這些由這種情況引起的空泡化實(shí)體類似于光鏡下組織載玻片處理過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)積累或偽影。

LAMP-2表達(dá)比較：LAMP-2免疫組化染色檢測(cè)磷脂積累（圖）。將細(xì)胞與10µM的PL誘導(dǎo)藥物（阿米卡星、胺碘酮或舍曲林）或25µM的對(duì)乙酰氨基酚孵育48小時(shí)。在相同條件下，與HepG2細(xì)胞相比，類器官細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中具有更明顯的LAMP-2陽性染色。舍曲林處理組的兩種細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色陽性最強(qiáng)。

PL證實(shí)：用透射電鏡證實(shí)了藥物誘導(dǎo)的肝臟類器官磷脂病（圖）。10µM胺碘酮處理48h后，類器官產(chǎn)生明顯的層狀體。

基因表達(dá)（LSS和P8 mRNA）的變化：LSS和P8為PL生物標(biāo)記物。為了評(píng)估藥物誘導(dǎo)的PL的嚴(yán)重程度，采用qPCR方法檢測(cè)了特異性基因標(biāo)記物的變化值。兩種培養(yǎng)體系中的細(xì)胞分別用胺碘酮（5µM，10µM）或舍曲林（5µM，10µM）處理48小時(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞對(duì)10µM舍曲林毒性非常敏感，因此在這種條件下不可能提取RNA。如圖所示，類器官的LSS和P8 mRNA表達(dá)水平均有上調(diào)。

06

類器官面臨的挑戰(zhàn)

成本：類器官作為新型的藥篩模型，成本雖然較PDX更低，但還是高于細(xì)胞系。類器官成本占比較高的包括培養(yǎng)使用的基質(zhì)膠。

目前大多類器官本身并不具備血管化的結(jié)構(gòu)。因此，隨著類器官體積的增長(zhǎng)，類器官受限于氧氣的缺失以及代謝廢物的增加，可能導(dǎo)致的組織壞死。已有研究構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞微環(huán)境的腫瘤類器官，將類器官腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel上共同培養(yǎng)，生成血管結(jié)構(gòu)以期解決類器官血管化缺失的問題。

血管化以外的難點(diǎn)還包括模擬腫瘤和免疫環(huán)境的相互作用關(guān)系。2019年Nature Protocol期刊發(fā)表了腫瘤類器官和免疫細(xì)胞共同培養(yǎng)的相關(guān)protocol，可以體現(xiàn)和模擬出腫瘤微環(huán)境的部分特征。以上皮類器官和免疫細(xì)胞共培養(yǎng)模型為例，可通過在培養(yǎng)基中添加活化的免疫細(xì)胞、在組織消化成單細(xì)胞后和免疫細(xì)胞共同生長(zhǎng)、添加ECM中的重組細(xì)胞因子等方法重塑類器官和免疫細(xì)胞的相互作用。

相比于單個(gè)類器官，類器官系統(tǒng)的構(gòu)建能夠?qū)λ幬锆熜Ш蜐撛诙拘宰龀龈�完整全面的評(píng)估。目前類器官僅能檢測(cè)出藥物對(duì)于腫瘤的抑制效果，對(duì)于其他器官組織是否存在其他副作用和安全性風(fēng)險(xiǎn)并不能做出預(yù)判。

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