表皮是一個(gè)多層組織，在保護(hù)機(jī)體免受水分流失、外來(lái)生物、紫外線和有害病原體的侵害方面起著至關(guān)重要的作用，特別是表皮的最外層——角質(zhì)層（SC），提供了一個(gè)滲透性屏障，防止水分和電解質(zhì)的流失，這種屏障功能的基本介質(zhì)包括神經(jīng)酰胺、膽固醇和長(zhǎng)鏈脂肪酸類(lèi)代謝物，它們的改變有可能導(dǎo)致人類(lèi)皮膚疾病，包括牛皮癬和特應(yīng)性皮炎。人鋅指(C2H2型)蛋白ZNF750是一種參與終表皮分化和癌癥的轉(zhuǎn)錄因子，此前有研究證實(shí)ZNF750基因的移碼突變可引起脂溢性皮炎。

2023年4月，意大利羅馬第二大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)、賈偉教授等多個(gè)團(tuán)隊(duì)共同在Science Advances (IF=14.957)期刊發(fā)表題為“ZFP750 affects the cutaneous barrier throughregulating lipid metabolism”的研究論文，揭示了ZFP750作為皮膚發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，直接和/或間接調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺生物合成關(guān)鍵酶的表達(dá)，對(duì)皮膚屏障通透性至關(guān)重要，這將有助于了解幾種人類(lèi)皮膚病的發(fā)病機(jī)制。（賈偉教授作為本文共同作者之一，且本研究中脂質(zhì)組檢測(cè)分析由麥特繪譜協(xié)助完成）

1. 轉(zhuǎn)錄因子ZFP750在體內(nèi)的作用

如圖1 所示，構(gòu)建基因敲除（KO）小鼠模型，導(dǎo)致Zfp750 mRNA有效降低。出生后，Zfp750−/−小鼠的皮膚有光澤、皺紋和粘性，眼睛已經(jīng)睜開(kāi)。妊娠第16.5天（E16.5），眼瞼明顯缺失。此外，與對(duì)照組相比，Zfp750−/−小鼠的體重有所減輕，并在20小時(shí)內(nèi)死亡。而雜合小鼠Zfp750+/−未表現(xiàn)明顯的表型，與WT小鼠相似。皮膚屏障功能分析顯示，與對(duì)照組相比，Zfp750−/−小鼠的表皮厚度減少，角質(zhì)層（SC）緊密壓實(shí)，出生后9小時(shí)內(nèi)體重下降了15%。體重減輕是由于皮膚滲透性屏障功能受損導(dǎo)致的脫水，通過(guò)使用甲苯胺藍(lán)排除法評(píng)估了由外到內(nèi)的滲透性屏障，皮膚屏障功能的改變也由內(nèi)到外緊密連接屏障試驗(yàn)證實(shí)。這些結(jié)果表明，Zfp750−/−小鼠在出生后不久死亡，并顯示出“由外向內(nèi)”和“由內(nèi)向外”皮膚屏障功能的嚴(yán)重改變，從而導(dǎo)致脫水，表明ZFP750在皮膚滲透性屏障中起著至關(guān)重要的作用。

圖1. Zfp750−/−小鼠皮膚屏障功能的改變

2. Zfp750−/−小鼠皮膚發(fā)育受損

在人角質(zhì)形成細(xì)胞中，ZNF750既是祖基因的抑制因子，也是分化基因的激活因子。研究人員評(píng)估ZNF750在發(fā)育中的作用，分析了其缺失對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響，以及對(duì)基底層(Krt14陽(yáng)性細(xì)胞)向棘層(Krt10陽(yáng)性細(xì)胞)轉(zhuǎn)移的影響。分析發(fā)現(xiàn)在Zfp750−/−小鼠的表皮中，觀察到幾個(gè)細(xì)胞Krt14和Krt10都呈陽(yáng)性，這表明ZFP750的缺失延遲/損害了早期分化階段的角蛋白開(kāi)關(guān)，Krt14 mRNA表達(dá)的增加也說(shuō)明了這一點(diǎn)，并使小鼠表皮的增殖率顯著增加。進(jìn)一步分析表明p63和ZFP750在表皮發(fā)育過(guò)程中協(xié)同作用，涉及p63-ZFP750和KLF4的調(diào)控軸在小鼠皮膚發(fā)育中并不完全保守。

ZNF750也參與控制表皮晚期分化基因的表達(dá)。隨后分析屏障缺陷與角化包膜蛋白成分的表達(dá)改變的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比，Zfp750−/−新生小鼠中受ZNF750調(diào)控的絲聚蛋白和兜甲蛋白（loricrin）表達(dá)下調(diào)，同時(shí)內(nèi)披蛋白（IVL）上調(diào)。這可能是由于組織試圖恢復(fù)屏障功能。

3. Zfp750−/−小鼠脂質(zhì)屏障組成改變

通過(guò)免疫熒光分析定位神經(jīng)酰胺（Cer）和葡萄糖神經(jīng)酰胺(GlcCer)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠中GlcCer/Cer主要定位于SC層和顆粒層，而在Zfp750−/−小鼠皮膚SC中完全不存在。

尼羅紅染料分析SC的脂質(zhì)組成，在從對(duì)照小鼠分離的SC中有極性和非極性脂質(zhì)的存在（明亮的金黃色）；相比之下，在Zfp750−/−小鼠的SC中，這兩種脂質(zhì)的存在都明顯減少，這種減少對(duì)于非極性脂質(zhì)(Cer，綠色熒光)更為明顯。分化3天后，來(lái)自Zfp750−/−小鼠的角質(zhì)細(xì)胞也證實(shí)了非極性脂質(zhì)的減少。

此外，WT小鼠的脂質(zhì)呈織狀分布，而Zfp750−/−小鼠的SC中的脂質(zhì)呈珍珠狀分布，透射電鏡分析也證實(shí)了SC中脂肪的點(diǎn)狀分布。WT小鼠超微結(jié)構(gòu)分析顯示，顆粒層與SC之間的界面充滿片狀體(LBs)，呈橢圓形囊泡；相比之下，Zfp750−/−小鼠的界面幾乎沒(méi)有LBs。Zfp750−/−小鼠表皮中的酶原和酶活性形式均顯著減少，進(jìn)一步證實(shí)Zfp750−/−小鼠中LBs的減少。

這些結(jié)果表明，ZFP750的缺失會(huì)改變表皮脂質(zhì)組成，從而導(dǎo)致皮膚通透性屏障功能障礙。

圖2. Zfp750−/−表皮脂質(zhì)組成異常

4. ZFP750調(diào)節(jié)角質(zhì)化包膜相關(guān)蛋白和脂質(zhì)成分的基因表達(dá)

小鼠表皮總RNA測(cè)序分析顯示，ZFP750基因缺失導(dǎo)致1722個(gè)基因表達(dá)改變，負(fù)責(zé)角化、細(xì)胞遷移和增殖過(guò)程的978個(gè)基因被上調(diào)，特別是參與角化過(guò)程的基因Krt2、Krt6b、Sprr1b、Sprr2d等，這可能是由于ZFP750缺失后分化程序的失調(diào)。此外，缺失ZFP750還導(dǎo)致編碼膽固醇酯（CE）晚期分化標(biāo)記和前體的幾個(gè)基因下調(diào)，包括Lce1i、Lce1h、Lce1l和Lce1m。相反，Zfp750−/−表皮中有744個(gè)基因下調(diào)，基因本體（GO）分析顯示脂質(zhì)代謝和角質(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)通路富集。其中55個(gè)參與脂質(zhì)代謝的基因(Degs1、Degs2、Sgpl1、Elovl6、Elovl7和Kdsr)的表達(dá)在Zfp750−/−小鼠皮膚中被抑制。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子ZFP750通過(guò)控制參與角化細(xì)胞包膜蛋白和脂質(zhì)成分組裝的基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)表皮發(fā)育。

圖3. Zfp750基因缺失會(huì)導(dǎo)致參與脂質(zhì)代謝、角質(zhì)細(xì)胞分化和角質(zhì)形成的基因失調(diào)

5. ZFP750是表皮神經(jīng)酰胺代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子

表皮神經(jīng)酰胺及其相應(yīng)的代謝物在皮膚屏障完整性的形成和維持中起著至關(guān)重要的作用。含有極長(zhǎng)鏈(VLC)和超長(zhǎng)鏈(ULC) FAs的神經(jīng)酰胺的從頭合成始于表皮自旋/顆粒層的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，第一步是絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)使棕櫚酰輔酶A和L-絲氨酸縮合；這些生物合成途徑是在Zfp750−/−小鼠表皮中特有的。Sptlc1亞基和3-酮二氫鞘氨醇還原酶(Kdsr)的表達(dá)顯著降低，并且分別催化二羥基神經(jīng)酰胺和神經(jīng)酰胺生成的神經(jīng)酰胺合成酶(CerS)和去飽和酶(Degs)的表達(dá)因缺失ZFP750而失調(diào)。

神經(jīng)酰胺的FA成分VLC和ULC FAs是在角質(zhì)形成細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的，它們的合成由7個(gè)酶組成的家族介導(dǎo)，稱(chēng)為VLC FAs延伸1至7 (Elovl1至Elovl7)，該家族催化了構(gòu)成長(zhǎng)鏈FA延伸循環(huán)的四個(gè)反應(yīng)中的第一個(gè)反應(yīng)和限速反應(yīng)。觀察到在WT組動(dòng)物角化細(xì)胞分化過(guò)程中Elovl6的表達(dá)增加，Zfp750−/−小鼠中Elovl7的表達(dá)部分降低。另一方面，二酰基甘油�；�轉(zhuǎn)移酶（Dgat2）和中性鞘磷脂酶(Smpd3)在Zfp750−/−角化細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)上調(diào)被抵消。這些結(jié)果表明ZFP750是控制脂質(zhì)角化包膜形成過(guò)程中關(guān)鍵酶表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。

圖4. ZFP750控制神經(jīng)酰胺生物合成相關(guān)基因的表達(dá)

6. Zfp750−/−小鼠表皮脂質(zhì)成分失調(diào)

進(jìn)一步驗(yàn)證，對(duì)小鼠表皮進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果顯示，在皮膚屏障通透性中起關(guān)鍵作用的神經(jīng)酰胺類(lèi)的數(shù)量嚴(yán)重失調(diào)，特別是飽和神經(jīng)酰胺(d18:0/16:0)、(d18:1/16:0)、(d18:0/24:0)、(d18:0/26:0)均有顯著的積累。相反，在Zfp750−/−小鼠表皮中，C24-26單不飽和神經(jīng)酰胺顯著減少，如(d18:1/24:0)、(d18:1/25:0)、(d18:1/26:0)和(d18:1/26:1)。這種變化可能是神經(jīng)酰胺生物合成中涉及的關(guān)鍵酶的mRNA水平降低的結(jié)果。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，大多數(shù)神經(jīng)酰胺也通過(guò)鞘磷脂合成酶轉(zhuǎn)化為鞘磷脂。由于幾種神經(jīng)酰胺種類(lèi)的數(shù)量減少，還觀察到突變小鼠表皮鞘磷脂的顯著減少。

表皮中性脂質(zhì)代謝在維持皮膚適當(dāng)?shù)臐B透性屏障方面也起著關(guān)鍵作用。分析顯示，從Zfp750−/−小鼠表皮中甘油三酯(TAG)的數(shù)量顯著減少，這與突變小鼠表皮中幾種1,2-二酰基甘油的顯著增加有關(guān)。

膽固醇是表皮的重要組成部分，膽固醇酯（CE）的極性比游離膽固醇低，可以增強(qiáng)皮膚的疏水性，促進(jìn)屏障功能。特別是新生小鼠的表皮主要含有CE和C16-18 FA。突變小鼠表皮的膽固醇酯(C16-18)水平顯著降低。

LB中所含的磷脂在角質(zhì)層SC中代謝為游離FAs，這反過(guò)來(lái)又有助于SC的酸化。研究表明，ZFP750是磷脂的適當(dāng)生物合成所必需的。具體來(lái)說(shuō)，Zfp750−/−小鼠表皮中磷脂，即磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿和磷脂酰肌醇的含量明顯失調(diào)，包括醚鍵在內(nèi)的幾種磷脂酰絲氨酸在Zfp750−/−小鼠表皮中有明顯的積累，同時(shí)發(fā)現(xiàn)少數(shù)磷脂酰肌醇減少。

因此，脂質(zhì)組學(xué)分析證實(shí)了關(guān)鍵角化細(xì)胞特異性脂質(zhì)的減少，證明了ZFP750在表皮中允許合成適當(dāng)脂質(zhì)屏障方面的相關(guān)性。

最后，研究人員通過(guò)小干擾RNA (siRNA)抑制ZNF750在人角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)評(píng)估ZNF750對(duì)表皮脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)是否在人類(lèi)中也保守，分析顯示Degs1、Degs2、Dgat2、Smpd3、Elovl6和Elovl7 mRNA水平顯著降低，它們的失調(diào)與非極性脂質(zhì)水平顯著降低有關(guān)。ZNF750直接和/或間接調(diào)控表皮脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶的表達(dá)。

圖5. Zfp750基因缺失導(dǎo)致表皮脂質(zhì)組成受損

小結(jié)

綜上，本研究確定了人鋅指(C2H2型)蛋白ZFP750是表皮屏障功能的主要調(diào)節(jié)劑，通過(guò)控制參與幾種表皮脂質(zhì)合成酶的表達(dá)來(lái)控制表皮脂質(zhì)組成，這將有助于了解幾種人類(lèi)皮膚病的發(fā)病機(jī)制。

圖6. ZFP750作為表皮脂質(zhì)生物合成的主要調(diào)節(jié)因子

原文信息

Butera A, et al. ZFP750 affects the cutaneous barrier through regulating lipid metabolism. Sci Adv. 2023.

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