由于多重技術(shù)的快速發(fā)展，我們需要分析和解釋的圖像數(shù)據(jù)越來(lái)越復(fù)雜。這個(gè)系列，我們將回答研究人員或病理醫(yī)生在建立多重免疫熒光/免疫組織化學(xué)（mIF/IHC）或其他多通道圖像分析工作流程起始階段的常見(jiàn)問(wèn)題（FAQ）。我們提供實(shí)現(xiàn)高效和可重復(fù)的mIF/IHC分析的一般指南，主要適用于從3–5μm福爾馬林固定組織切片的多重染色（多達(dá)8個(gè)標(biāo)記）獲得的mIF/IHC數(shù)據(jù)。

 

下面的FAQ概述了與mIF/IHC圖像分析相關(guān)的話(huà)題，從分析流程到軟件問(wèn)題。精心設(shè)計(jì)的圖像分析流程將為用戶(hù)提供豐富的、基于組織的生物信息。

1. 多重免疫熒光圖像分析的基本步驟是什么？

多重免疫熒光圖像分析通常分為四個(gè)關(guān)鍵步驟：
1）組織識(shí)別和分割；
2）細(xì)胞分割；
3）細(xì)胞分類(lèi)和分類(lèi)器的驗(yàn)證；
4）測(cè)量輸出和數(shù)據(jù)解釋。

有時(shí)可能需要額外的步驟，如組織類(lèi)型分割；在其他情況下，某些步驟（例如基于像素的細(xì)胞分割）可能是不必要的。

2.圖像分析需要多長(zhǎng)時(shí)間？

將根據(jù)圖像的復(fù)雜性和數(shù)量而有所不同。在很大程度上取決于要分析的切片數(shù)量和大小，包括文件大小和像素?cái)?shù)。一個(gè)視野可能需要幾秒鐘來(lái)進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)和分類(lèi)，而一張包含30個(gè)通道的全切片圖像可能需要數(shù)小時(shí)來(lái)處理組織識(shí)別分割、從基質(zhì)中分割腫瘤及最終分割細(xì)胞。此外，圖像托管的地方可能很重要，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)或在云上處理圖像有助于緩解數(shù)據(jù)存儲(chǔ)問(wèn)題，但需要傳輸可能數(shù)TB的圖像數(shù)據(jù)。

3.我們應(yīng)該分析每張組織切片的圖像嗎？

要分析的圖像數(shù)量取決于項(xiàng)目需求。例如，并非所有圖像都需要細(xì)胞密度分析�？紤]到所分析的組織的異質(zhì)性，分析往往聚焦于生物標(biāo)記物高表達(dá)的區(qū)域即“熱點(diǎn)”，“熱點(diǎn)”分析已用于對(duì)按風(fēng)險(xiǎn)大小對(duì)患者進(jìn)行分層⑴⑵。然而，當(dāng)需要選擇圖像進(jìn)行分析時(shí)，避免依賴(lài)于操作人員的采樣偏差至關(guān)重要⑶。更復(fù)雜空間特征的檢測(cè)和細(xì)胞間相互作用的測(cè)量往往需要對(duì)整個(gè)切片進(jìn)行分析。

4.哪些圖像分析步驟可以自動(dòng)化？哪些步驟可以分批進(jìn)行？

大多數(shù)步驟最終都可以自動(dòng)化，因?yàn)榍懊娴氖止すぷ髟撟龅亩家呀?jīng)做了。為細(xì)胞分類(lèi)器創(chuàng)建驗(yàn)證集和測(cè)試集允許用戶(hù)測(cè)試各種變量和閾值，但一次只能創(chuàng)建一種細(xì)胞的。

應(yīng)始終小心對(duì)待圖像分析的批處理，因?yàn)椴煌�設(shè)置下的不同儀器不會(huì)產(chǎn)生完全相同的數(shù)據(jù)，即使使用完全相同的標(biāo)本。理想情況下，在充分的培訓(xùn)和參數(shù)調(diào)整的前提下，所有步驟最終都可以一次處理一批，但必須有防護(hù)措施必須到位：防止燈泡熄滅、光學(xué)元件漂移和抗體改變。每批使用單獨(dú)的組織（標(biāo)準(zhǔn)塊）或細(xì)胞對(duì)照玻片有助于識(shí)別潛在問(wèn)題 。

5.圖像分析產(chǎn)生能得到什么檢測(cè)結(jié)果？

最常見(jiàn)的指標(biāo)是分割組織內(nèi)的細(xì)胞密度（例如，每個(gè)癌巢或每平方毫米的CD3+細(xì)胞數(shù)）、細(xì)胞百分比（例如，CD3+CD8+細(xì)胞占CD3+的百分比）和最近鄰測(cè)量值（例如，從CD3+細(xì)胞到最近癌細(xì)胞的平均微米數(shù)）。

多重IF/IHC識(shí)別和定位組織內(nèi)復(fù)雜細(xì)胞表型的能力使我們能夠更好地從空間、位置等角度理解和描述組織微環(huán)境中的細(xì)胞生物學(xué)。單個(gè)細(xì)胞對(duì)象可以根據(jù)用戶(hù)定義的細(xì)胞表型分類(lèi)和單個(gè)細(xì)胞在圖像中唯一的X-Y坐標(biāo)位置來(lái)表征。然后，可以測(cè)量圖像中具有某種特征的所有細(xì)胞的空間特征和細(xì)胞間相互作用。這些測(cè)量可能包括熱點(diǎn)、到其他細(xì)胞類(lèi)型的距離、到組織標(biāo)注（腫瘤邊緣）的距離以及細(xì)胞的微環(huán)境分析⑷⑸⑹。

6.我的實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有生物信息技術(shù)人員。這會(huì)限制或影響我們分析mIF/IHC數(shù)據(jù)的能力嗎？

一點(diǎn)都不影響！許多軟件都是用戶(hù)友好的、易于使用，生成的數(shù)據(jù)集可以在簡(jiǎn)單的電子表格中處理。盡管從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，通過(guò)專(zhuān)業(yè)信息技術(shù)人員編寫(xiě)腳本和處理復(fù)雜的數(shù)據(jù)，靈活性和效率都能得到提升，但建立mIF/IHC能力并不需要生物信息學(xué)技術(shù)人員。 Image.sc forum等論壇提供了業(yè)內(nèi)人士提問(wèn)、交流的地方。

7.什么樣的新員工適合圖像分析這項(xiàng)工作？

尋找那些喜歡使用計(jì)算機(jī)和網(wǎng)絡(luò)的人，他們往往有很好的解決問(wèn)題和排除故障的能力，天性就喜歡在互聯(lián)網(wǎng)搜索、找答案。編寫(xiě)腳本和直觀地解釋原始數(shù)據(jù)的能力也非常重要。團(tuán)隊(duì)合作精神是必不可少的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)圖像分析師不是生物學(xué)或統(tǒng)計(jì)學(xué)方面的專(zhuān)家，他們往往需要尋求專(zhuān)家支持以填補(bǔ)知識(shí)空白。

8. 需要什么軟件來(lái)執(zhí)行圖像分析？

多重IF/IHC圖像分析可以使用商業(yè)軟件（如InForm、HALO、Visiopharm）或開(kāi)源軟件（如QuPath、CellProfiler、ImageJ）。商業(yè)軟件提供免編程、內(nèi)置功能和技術(shù)支持，但成本很高（通常為20000至100000美元）。通常，開(kāi)源軟件是免費(fèi)的，能夠?qū)崿F(xiàn)有限的圖像分析功能，包括光譜拆解、細(xì)胞分割和圖像拼接。

一般來(lái)說(shuō)，商業(yè)軟件提供更直觀的分析流程，并能提供完善的培訓(xùn)和支持，這可能會(huì)使剛接觸圖像分析的用戶(hù)受益（或有助于員工更替）。開(kāi)源軟件提供了更大的靈活性和定制能力，但可能有更陡峭的學(xué)習(xí)曲線(xiàn)來(lái)開(kāi)發(fā)和完善用戶(hù)的工作流程。使用開(kāi)源軟件實(shí)現(xiàn)自定義功能可能需要用戶(hù)進(jìn)行額外編程，但開(kāi)源社區(qū)應(yīng)用程序和其擴(kuò)展程序往往已經(jīng)可以滿(mǎn)足特定的分析需求。

9.需要什么硬件支持來(lái)進(jìn)行圖像分析？

硬件取決于您經(jīng)常分析的圖像數(shù)量和大小以及您使用的軟件。mIF/IHC分析軟件通�？梢栽跇�(biāo)準(zhǔn)臺(tái)式機(jī)或筆記本電腦上運(yùn)行。16 GB的RAM通常足以進(jìn)行簡(jiǎn)單的全切片分析，可能需要32 GB或更多的RAM進(jìn)行復(fù)雜的全切片分析，尤其是在同時(shí)運(yùn)行多個(gè)線(xiàn)程或程序的情況下。RAM限制可能是某些軟件運(yùn)行過(guò)程的瓶頸，因?yàn)橄袼胤诸?lèi)器和更復(fù)雜的分析對(duì)RAM需求很大。

其他過(guò)程，如細(xì)胞檢測(cè)，則不那么繁重。多線(xiàn)程計(jì)算（如細(xì)胞檢測(cè)）受益于多核CPU（以及多個(gè)CPU）。如果有足夠的技術(shù)人員，大部分處理可以轉(zhuǎn)移到云計(jì)算上。不過(guò)，數(shù)千兆字節(jié)的圖像傳輸仍然很花時(shí)間。

10.如果將圖像分析交給合作者或?qū)�業(yè)第三方服務(wù)商處理，有問(wèn)題嗎？

理想情況下，同一實(shí)驗(yàn)室執(zhí)行染色和圖像分析，這樣出現(xiàn)問(wèn)題的話(huà)往往很快可以得到解決。然而，外部合作專(zhuān)家和專(zhuān)業(yè)第三方機(jī)構(gòu)也是獲取和分析mIF/IHC數(shù)據(jù)的可行途徑。在與這些合作者接觸時(shí)，盡量多花些時(shí)間詳細(xì)了解他們的圖像分析工作流程。問(wèn)他們，對(duì)于一個(gè)特定的生物標(biāo)記物，細(xì)胞亞群是如何被分類(lèi)為染色陽(yáng)性的。他們是不是對(duì)你認(rèn)為是真實(shí)的東西設(shè)定了閾值？要設(shè)置陽(yáng)性染色、陰性染色和背景，問(wèn)他們分析中包括或排除組織的哪些區(qū)域。檢查原始分割結(jié)果，而不僅僅是總結(jié)和選定的局部快照。圖像分析流程中可能會(huì)出現(xiàn)很多錯(cuò)誤，第三方可能不像我們自己那樣積極尋找錯(cuò)誤，畢竟，我們自己對(duì)最終的數(shù)據(jù)和檢測(cè)報(bào)告負(fù)責(zé)。

11.我應(yīng)該在分析圖像之前預(yù)處理圖像還是從原始圖像開(kāi)始？

答案取決于生成圖像的方法。某些數(shù)據(jù)采集方法在不同通道之間存在嚴(yán)重串?dāng)_（crosstalk），往往需要線(xiàn)性拆解去除來(lái)自其他通道的污染。其他類(lèi)型的數(shù)據(jù)采集，如質(zhì)譜成像細(xì)胞儀（imaging mass cytometry），可以顯示密切相關(guān)同位素之間的串?dāng)_，不需要對(duì)分離良好的通道進(jìn)行處理。建議進(jìn)行一些手動(dòng)質(zhì)量控制；并非所有樣品都能在染色和封片過(guò)程中保持完整和不丟損。將多個(gè)圖像拼接到一個(gè)文件中常�？梢詫�(shí)現(xiàn)更復(fù)雜的空間分析和更好的可視化。

12.我們應(yīng)該警惕圖像中的哪些危險(xiǎn)信號(hào)？

清楚地了解染色是如何進(jìn)行和圖像如何生成對(duì)于高質(zhì)量的圖像分析至關(guān)重要。光譜拆解不好可能導(dǎo)致從一個(gè)通道到另一個(gè)通道的熒光污染，從而導(dǎo)致誤報(bào)信號(hào)。熒光強(qiáng)度或背景水平的批次或玻片變化都可能導(dǎo)致需要重新染色、重新成像或需要玻片特定的圖像分析策略。要注意的染色問(wèn)題包括非特異性染色和非優(yōu)化染色順序，這些染色順序會(huì)導(dǎo)致抗原可用性的“傘效應(yīng)”不可用。最后，在流程早期排除質(zhì)量差的組織樣本或質(zhì)區(qū)域?qū)⑹蛊浜蟮膱D像分析更準(zhǔn)確。

13.如何檢查圖像分析的質(zhì)量？

mIF/IHC成像的質(zhì)量控制（QC）對(duì)于確保報(bào)告準(zhǔn)確至關(guān)重要。成功的多重IF/IHC QC應(yīng)逐一解決組織學(xué)制片、染色、成像以及分析前階段等病理學(xué)和免疫學(xué)等各方面的技術(shù)問(wèn)題。QC的某些方面可以通過(guò)圖像分析軟件進(jìn)行，而其他則需要人工觀察。簡(jiǎn)單地說(shuō)，褶皺、撕裂、組織干燥區(qū)域和大體固定偽影應(yīng)標(biāo)記出來(lái)并從分析中排除（手動(dòng)或使用像素分類(lèi)器）。飽和度（由于染色或成像）、離焦區(qū)域、一個(gè)標(biāo)記物被共定位標(biāo)記物的嚴(yán)重覆蓋、光譜通道之間的相互滲漏和清晰的染色梯度應(yīng)都能通過(guò)重新成像或?qū)⑵渑懦�掉�?lái)改善。最后，意外的染色模式、標(biāo)記物定位和多標(biāo)記物表型（不應(yīng)在同一細(xì)胞中共定位的標(biāo)記物）可能會(huì)使單個(gè)玻片或整個(gè)批次都不合格。

陰性對(duì)照在每個(gè)感興趣的通道中應(yīng)僅包含自熒光或非特異性信號(hào)。陽(yáng)性對(duì)照，（每次運(yùn)行結(jié)果都應(yīng)一直有可重復(fù)性和一致性），應(yīng)與前幾批的相同陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行比較，以驗(yàn)證在每個(gè)通道中觀察到的峰值、平均和最小強(qiáng)度具有可比性。

14.如何處理批次變化？

應(yīng)仔細(xì)、認(rèn)真地建立圖像處理流程，以使其具有高度的重復(fù)性。使用允許無(wú)偏量化的工具（例如直方圖和測(cè)量圖）。使用內(nèi)部對(duì)照（例如扁桃體染色或其他組織特異性對(duì)照組織染色）作為指南。

mIF/IHC中常見(jiàn)的技術(shù)導(dǎo)致的差異往往源于組織質(zhì)量差、染色過(guò)程不一致和圖像采集不穩(wěn)定。如果在圖像分析之前無(wú)法緩解這些問(wèn)題，則使用z評(píng)分進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化可能是一個(gè)解決方案。否則，您可能需要對(duì)每個(gè)批次設(shè)定其特定的閾值和細(xì)胞分類(lèi)器。

15.如何處理患者內(nèi)變異？

組織微環(huán)境通常是異質(zhì)的，因此同時(shí)分析多個(gè)感興趣區(qū)域（ROI）至關(guān)重要。將組織分割為腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)等區(qū)域在空間上解析數(shù)據(jù)特征。隨機(jī)選擇的ROI之間的良好一致性將充分支持使用聚合匯總值（例如，每個(gè)患者的平均細(xì)胞密度）。無(wú)論組織切片、或整個(gè)切片組織或組織微陣列核的大小如何，微環(huán)境結(jié)構(gòu)中的異質(zhì)性不可避免地存在并且是可以容忍的，我們的目標(biāo)是識(shí)別具有強(qiáng)大臨床適用性的空間免疫生物標(biāo)記物。

16.我的數(shù)據(jù)結(jié)果非常復(fù)雜，有幾十個(gè)標(biāo)記。如何解讀結(jié)果？

降低項(xiàng)目復(fù)雜性的最簡(jiǎn)單方法是使用幾十個(gè)標(biāo)記進(jìn)行初步試點(diǎn)研究，并選擇研究所需的最簡(jiǎn)單、最有效的組合。與免疫學(xué)家或病理學(xué)家討論標(biāo)志物panel的成員，并根據(jù)無(wú)偏降維方法（如檢測(cè)到的復(fù)雜表型的主成分分析）做出決策。

此外，機(jī)器學(xué)習(xí)分類(lèi)器和/或無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)（t-SNE/UMAP）通�？梢宰R(shí)別復(fù)雜的細(xì)胞表型。要有思想準(zhǔn)備有些細(xì)胞不適合預(yù)定的表型！用戶(hù)必須仔細(xì)考慮如何處理和驗(yàn)證這些已識(shí)別的細(xì)胞類(lèi)型。為此，請(qǐng)仔細(xì)檢查細(xì)胞分割和表型的準(zhǔn)確性，并確保它們最適合您的目標(biāo)（例如，容易識(shí)別淋巴結(jié)中密集T細(xì)胞的方法可能無(wú)法識(shí)別腫瘤組織中的大巨噬細(xì)胞）。

17. mIF/IHC中的潛在表型和空間指標(biāo)很多，如何只報(bào)告最有用的數(shù)據(jù)？

mIF/IHC研究中表型分析是預(yù)先確定的研究問(wèn)題的核心，理論假說(shuō)應(yīng)推動(dòng)mIF/IHC設(shè)計(jì)。這種方法防止由于多次比較、調(diào)整而造成的無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的困境。使用與特定患者或組織特征相關(guān)的AI表型分析進(jìn)行二次探索性分析對(duì)于發(fā)現(xiàn)新表型非常重要⑺。變量選擇（例如，L1正則化）或縮減（例如，主成分分析）方法可用于將表型或距離子集化，并具有潛在的臨床價(jià)值⑻⑼。

18.在發(fā)表論文時(shí)需要給出多少圖像分析流程方面的信息？

自動(dòng)化的完整腳本都應(yīng)包含在補(bǔ)充數(shù)據(jù)中。除特殊情況外，還應(yīng)提供分析的代表性典型圖像。目前有越來(lái)越多的軟件方便地支持做這些事情（做總結(jié)報(bào)告），這也應(yīng)該是選擇圖像分析軟件時(shí)應(yīng)考慮的因素之一。一些商業(yè)軟件這方面相當(dāng)不友好，從而減少任何人復(fù)制或引用您的工作的機(jī)會(huì)。

19.我在哪里可以找到更多信息來(lái)學(xué)習(xí)圖像分析？

商業(yè)軟件通常包括充分支持和培訓(xùn)來(lái)幫助建立業(yè)務(wù)。本行業(yè)相關(guān)專(zhuān)業(yè)軟件網(wǎng)站、在線(xiàn)課程和講座是往往讓您知道某軟件或決定mIF/IHC是否適合您的項(xiàng)目。在線(xiàn)論壇，如 image.sc開(kāi)源項(xiàng)目是非常好的資源。然而，它們的好處往往需要您花許多時(shí)間來(lái)學(xué)習(xí)和思考才能得到。關(guān)于多重成像的一些優(yōu)秀文獻(xiàn)綜述也是很好的起點(diǎn)⑽⑾⑿。

20.推薦的在線(xiàn)資源

培訓(xùn)視頻
https://www.youtube.com/playlist?list=PL5ESQNfM5lc7SAMstEu082ivW4BDMvd0U
https://www.youtube.com/c/NEUBIAS/videos?view=0&sort=dd&shelf_id=0
免費(fèi)圖像分析免費(fèi)電子書(shū)
https://www.springer.com/gp/book/9783030223854
指南和工具
https://www.nature.com/articles/s41592-021-01156-w
https://www.imagescientist.com/image-analysis#qupath
再現(xiàn)性
https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embj.2020105889
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33785609/
數(shù)據(jù)托管
https://www.nature.com/articles/d41586-020-00594-4
https://immunoatlas.org/pub

目前基于熒光標(biāo)記的多重?zé)晒饨M織免疫mIF/mIHC是探測(cè)腫瘤微環(huán)境應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，TLR專(zhuān)注于mIF/mIHC的相關(guān)技術(shù)，致力于將免疫染色（mIF/mIHC）、熒光圖像采集和分析的自動(dòng)化和智能化，研發(fā)用于mIF/mIHC的全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)（TR-Stainer）和熒光全切片掃描儀，其中TR-sWSI-5F熒光掃描儀是一款輕量入門(mén)級(jí)產(chǎn)品，具備快速5色掃描功能（藍(lán)色DAPI、綠色FITC、黃色TRITC、紅色Cy5、近紅外Cy7），滿(mǎn)足目前免疫熒光組化的絕大多數(shù)臨床需求。而TR-sWSI-MF（定制化） 的多光譜熒光掃描儀可以將多達(dá)15種顏色和自體熒光彼此得到很好的分離，從而使用戶(hù)信心百倍地專(zhuān)注于量化真正發(fā)生的生物學(xué)相互作用，能夠在整個(gè)切片上同時(shí)觀察和測(cè)量組織的細(xì)胞，包括多種細(xì)胞表型。

 

參考文獻(xiàn)

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