植物石蠟切片(番紅-固綠染色)

一、目的要求
1、 熟悉植物石蠟切片的制作過程。
2、 掌握番紅-固綠對染法的基本原理和具體方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理
石蠟切片法也是在研究植物細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面常用的制片方法。它可以使植物材料
切成薄的薄片，又可以切成連續(xù)薄片，切片經(jīng)染色，觀察效果甚好。番紅-固綠對染法，為植物制片上最普遍的一種二重染色法，其染色程序簡單并能清晰地顯示出細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。番紅
為堿性染料，能使細(xì)胞核及木質(zhì)化的細(xì)胞壁染成紅色；固綠為酸性染料，能使細(xì)胞質(zhì)及纖維
素的細(xì)胞壁染成綠色。

三、實(shí)驗(yàn)用品
（一） 器材
切片刀，切片機(jī)，溫箱，溫臺(tái)，解剖刀，鑷子，單面刀片，臺(tái)木，毛筆，蠟鏟，酒精燈，包
埋紙盒，染色缸，玻片盤，溫度計(jì)，臉盆。
（二）試劑
FAA 固定液，1%番紅，1%固綠，各級(jí)酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲
苯，石蠟，郝普特氏明膠粘片劑，樹膠。
試劑配法：
1、FAA 固定液（福爾馬林-醋酸-灑精混合液）
福爾馬林 5 ml
50%或 70%的灑 90 ml
冰醋酸 5 ml
此液適用于植物組織，此液中的酒精，有用 50%的，也有用 70%的，一般薄嫩的材料右用
50%的，厚硬的材料用 70%的，醋酸的用量也可根據(jù)材料情況作適當(dāng)?shù)母淖儯瑢σ恍┐髩K而
密實(shí)的組織可增加用量，同時(shí)減少福爾馬林的用量。固定時(shí)間可因材料及醋酸含量的變化而
異，一般為 5~20h。固定的材料，一般無需用水洗，可直接從 70%的酒精開始脫水。
1、 1%番紅
番紅 1g 溶于 100ml 水中。
2、 1%固綠
1g 固綠溶于 100ml95%酒精中。
3、郝普特氏明膠粘片劑
明膠 1g
蒸餾水 100ml
石炭酸 2g
甘油 15ml
配制時(shí)先將明膠溶解于 30℃的蒸餾水中（在水浴鍋內(nèi)進(jìn)行），待溶解后再加石炭酸和甘油，
攪拌均勻后，趁熱過濾，貯存于玻璃瓶中。
（三）材料
大豆、小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆等。

四、實(shí)驗(yàn)程序
1、 取材
取已培養(yǎng)好的大豆、小麥、蠶豆根或莖、葉等用刀片將其尖端約 1.2cm 根尖切割下來，用刀片切割其成熟區(qū)部分成 5mm 長的小段（亦可切帶側(cè)根的部分），將切好的材料放入玻管中。
2、 固定
將 FAA 固定液倒入盛有材料的玻管中，固定時(shí)間為 24h。
3、 沖洗
用 70%酒精換洗 3 次，每次 0.5-2h。
4、 脫水
80%、90%酒精各 1-2h，純酒精（中間換一次）1-2h。
5、 透明
等量純酒精及二甲苯中 1-2h，二甲苯（中間換一次）1-2h。
6、 透蠟
方法同前。
7、 包埋
方法同前。
8、 切片
根為橫切面，其厚度為 8~10um。
9、 貼片。
方法同前。
10、番紅-固綠對染法染色程序如下：
（1）切片在二甲苯中脫蠟，約 10min。
（2）等量純酒精二甲苯 5min。
（3）經(jīng)純酒精，95%、90%、80%、70%、505、305 各級(jí)酒精各 5min。
（4）蒸餾水 2-5min。
（5）1%番紅水溶液染色 2h 左右。
（6）用水洗去多余染液。
（7）50%、70%、80%、90%、95%各級(jí)酒精脫水 10min。
（8）1%的固綠（用 95%酒精配制）染色 10-40s。
（9）95%酒精洗一下。
（10）純酒精脫水 5min。
（11）等量純酒精二甲苯混合液中 5min。
（12）二甲苯 5min。
（13）中性樹膠封藏。
 
注意：
（1）番紅與固綠在酒精中很容易脫色，因此在酒精中脫水時(shí)，不能放置太久。
（2）用固綠對染之前應(yīng)檢查番紅染色的是否合適，所染顏色應(yīng)稍深一些，以防其在以后脫
水步驟中仍會(huì)脫色，如果太淺，應(yīng)退回重染。